猪带绦虫腺苷酸激酶的克隆及其重组蛋白免疫反应性的评价

戴佳琳，黄 江*，廖兴江，申萍香，周灵贵，刘玉江

(贵阳医学院多媒体形态学实验室，贵州贵阳550004)

猪带绦虫呈世界性分布，人是该寄生虫唯一的终宿主，成虫寄生于人的肠道可引起囊尾蚴病(囊虫病)。因此，对猪带绦虫功能基因组学研究，筛选与猪带绦虫结构、生长发育、物质和能量代谢、侵袭和免疫调节等密切相关的功能基因，是控制及消灭猪带绦虫的前提。本课题组前期已经成功构建了亚洲带绦虫、牛带绦虫及猪带绦虫成虫cDNA文库[1-2]，从该文库中筛选出腺苷酸激酶(adenylate kinase，ADK)。ADK分布广泛，是细胞中一种重要的核苷酸激酶，与其他磷酸转移酶对维持细胞中腺苷酸的正常含量及在能量代谢和酶活性调节中起着重要的作用。国内外对猪带绦虫ADK方面的研究尚未见报道，本研究对ADK原核表达和免疫学鉴定，为进一步探讨它的酶学特性及猪带绦虫能量代谢及非能量代谢方面的研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料 亚洲带绦虫病人、猪带绦虫病人及牛带绦虫病人血清取自粪检阳性的带绦虫病人；猪带绦虫成虫cDNA质粒文库构建，ADK基因筛选均由本课题组完成[3]。原核表达质粒pET-28a(+)及E.coliBL-21/DE3由中山大学热带病防治教育部重点实验室惠赠。BamHⅠ、XhoⅠ、ExTaq酶、DNA Marker，蛋白分子量标准等试剂购自TaKaRa公司；T4连接酶、IPTG购自Promega公司。

1.2 引物设计及PCR扩增 根据已获得的全长ADK基因序列，利用DNAclub软件设计引物，由上海英骏生物公司合成。P1：5'-ATAGGATCCATG CCCGGGAATTC3'，在5'端引入BamHⅠ酶切位点；P2：5'-CCGCTCGAGTTACTTGATTCCCTTC3'，在 5'端引入XhoⅠ酶切位点。PCR产物经0.8 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定回收。

1.3 重组表达质粒的构建及诱导表达和纯化 PCR产物和pET-28a(+)载体分别经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切处理，回收、连接后转入E.coliBL-21/DE3感受态细胞，摇菌培养后依次进行质粒提取，双酶切和PCR鉴定。阳性菌液加入IPTG诱导表达，SDSPAGE电泳检测[3]，同时设pET-28a(+)质粒的诱导前后及重组质粒的诱导前作对照。菌体超声裂解后上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，判断重组蛋白的可溶性。菌体裂解液经Ni螯合物亲和层析树脂(Ni-NTA)层析柱纯化，SDS-PAGE分析。

1.4 Western blot分析 将纯化的蛋白进行SDSPAGE电泳，转膜，室温封闭，分别以亚洲带绦虫病人阳性血清、牛带绦虫病人阳性血清、猪带绦虫病人阳性血清、猪带绦虫感染猪阳性血清为一抗进行反应，以正常人血清为一抗作为阴性对照。与辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人IgG、山羊抗猪IgG室温孵育，DAB显色，超纯水终止反应。

2 结 果

2.1 重组表达质粒的鉴定 将重组表达质粒进行PCR和双酶切鉴定，0.8 g/L琼脂糖凝胶电泳结果显示在约600 bp有一清晰条带，与目的基因大小基本相符，经测序表明插入序列与理论序列一致，证明成功构建了重组质粒，命名为pET-Ts-ADK(图1)。

2.2 重组蛋白表达纯化结果 将构建的重组质粒pET-Ts-ADK转化到E.coliBL21/DE3中表达，超声裂解后SDS-PAGE电泳分析表明在约30 ku处出现目的蛋白，通过Ni-NTA层析纯化目的蛋白(图2)。

2.3 Western blot分析 以感染亚洲带绦虫、猪带绦虫、牛带绦虫的患者血清及猪带绦虫感染猪的阳性血清为一抗，进行western blot，结果出现较清晰的条带，而相应位置阴性对照无反应条带(图3)。

3 讨 论

ADK又称为肌激酶，它广泛存在于有机体中，催化腺苷三磷酸(ATP)，使腺苷酸(AMP)磷酸化而生成腺苷二磷酸(ADP)，并通过这个反应来维持腺苷酸组成成分的体内平衡，是有机体中一种重要的酶类，在维持能量代谢及酶活性中起着重要的作用[4-10]。基于本课题组对3种人体带绦虫功能基因组学和蛋白质组学的比较研究的基础和方向，本研究选择了猪带绦虫成虫ADK作为目标基因，进行克隆表达和免疫学特性的初步研究。

前期试验通过多个生物信息学分析软件分析具有ADK的特征性氨基酸序列和保守功能域，筛选出ADK基因[1-2]。本研究在此基础上成功构建了猪带绦虫ADK原核表达载体pET-Ts-ADK，并获得了高效表达，经SDS-PAGE试验分析，结果表明该蛋白在上清和沉淀中均有表达，并且上清中的含量多于沉淀，由于该酶特别稳定，即使在0.1 NHCl中加热到100℃，或用三氯乙酸处理，也不易失去活性，在本实验得到ADK有活性的稳定的纯化蛋白，为以后的酶活性及其他实验奠定了基础，相对于以往实验中其他基因所得到的包涵体蛋白可更为方便的进行深入研究。Western blot结果表明，纯化蛋白能与被感染猪带绦虫的病人血清和猪血清、感染的牛带绦虫及亚带绦虫病人血清反应，表明重组蛋白在纯化后具有较好的免疫原性，提示Ts ADK可能是一种潜在诊断抗原。本研究为进一步研究ADK在诊断、药物及疫苗中的作用提供了实验依据。

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