邯郸市乙型肝炎基因分型及其临床意义研究

邓 健,马艳霞,郭娜娜,李瑞芳,李 杰,史宇辉,郭瑞玲

(1.邯郸市疾病预防控制中心,河北 邯郸 056008;2.北京大学医学部)

邯郸市乙型肝炎基因分型及其临床意义研究

邓 健1,马艳霞1,郭娜娜1,李瑞芳1,李 杰2,史宇辉2,郭瑞玲1

(1.邯郸市疾病预防控制中心,河北 邯郸 056008;2.北京大学医学部)

目的研究不同类型乙型肝炎病毒(HBV)感染者中HBV基因型分布情况及其临床意义。方法应用基因型特异性引物聚合酶链反应法(PCR),对180份HBV感染者血清进行基因型分型。结果180份标本中,162份(90%)可检出基因型,18份(10%)未检出基因型。162份HBV基因型分布为:B基因型1例(0.6%),C基因型159例(98.1%),B+C混合基因型2例(1.2%),未检出A、D、E、F基因型。结论邯郸地区HBV感染者中,基因型分布较单一,C基因型占绝对优势,同时存在少量B基因型及B+C混合基因型,C基因型可能与较严重的肝脏病变有关。

乙型肝炎病毒;基因型;聚合酶链反应

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0059)

1988年Okamoto等[1]第一次发现传统的血清亚型将被不同乙型肝炎病毒(HBV)毒株的基因亚组所取代,他们通过比较18株乙型肝炎病毒的全部核苷酸序列后,根据异源性≥8%或同源性＜92%,将其分为4个基因型,从而初步建立了基因分型体系。迄今为止,乙型肝炎病毒可分为A-H 8种基因型。研究发现,乙肝病毒的基因型呈地域性分布,不同的基因型致病性不同,且预后差异较大[2-5]。作者利用巢式PCR方法调查邯郸市乙肝病毒的基因型,为预防及治疗乙型肝炎提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清标本 共采集血清标本180份,其中,急性乙型肝炎7例,无症状携带者3例,慢性乙型肝炎119例,肝硬化30例,肝细胞癌21例。诊断符合2000年“病毒性肝炎防治方案”标准。

1.1.2 试剂和仪器 核酸提取试剂盒购自美国Promega公司;dNTP和Taq DNA聚合酶购自上海生工生物技术公司;琼脂糖、DNA分子量标志phiX174DNA/HaeⅢ、HBeAg检测试剂盒购自上海华美生物工程公司。台式高速离心机为德国Heraeus公司Biofuge 28R5,PCR热循环仪和凝胶成像仪为美国Bio-Rad公司产品。引物由上海生工生物技术公司合成,序列见表1。

表1 HBV基因分型引物及序列

1.2 方法

1.2.1 PCR法对HBV DNA基因型分型 HBV DNA提取按照美国Promega公司试剂盒说明书操作。HBV基因型及基因亚型检测的详细步骤参见文献[6]。采用多对引物和巢式PCR法扩增前S和S基因区进行HBV基因分型。HBV各基因型PCR产物大小为:A基因型为68 bp,B基因型为281 bp,C基因型为122 bp,D基因型为119 bp,E基因型为167 bp,F基因型为97 bp。

1.2.2 HBeAg的检测 应用上海华美生物技术有限公司生产的ELISA试剂盒检测,严格按说明书操作。

1.2.3 统计学分析 应用统计分析软件SPSS进行统计分析。

2 结果

2.1 电泳结果 根据PCR产物片断长度大小,观察电泳条带区分基因型(图1)。

2.2 HBV感染者基因检测结果 180份标本中,162份(90%)可检出基因型,18份(10%)未检出基因型。162份HBV基因型分布为:B基因型1例(0.6%),C基因型 159例(98.1%),B+C混合基因型2例(1.2%),未检出A、D、E、F基因型 。

2.3 HBeAg检测结果 180份标本中39份(21.7%)阳性,141份(78.3%)阴性。

2.4 统计分析

2.4.1 不同类型HBV感染者基因型分布:18份(10%)未检出基因型者分布在急性肝炎组6例,无症状携带组3例,慢性肝炎组9例。HBV基因型在不同类型HBV感染者中的分布差异无统计学意义,2例B+C基因型分别分布在肝硬化组和慢性肝炎组,1例B基因型在慢性肝炎组。

2.4.2 HBeAg阳性和阴性感染者中基因型分布:1例B基因型和2例B+C基因型均在HBeAg阴性感染组。

图1 B、C基因型电泳图

3 讨论

HBV基因型分布有明显的地域特征。基因A型分布于西北欧、北美和非洲,B、C型分布于亚洲,D型分布于地中海、中东地区和印度[7]。我国的HBV基因型以B、C型为主[7、8],其中北方以C型占绝大多数,而南方则以B型为主,新疆以D型多见。

近年来的研究表明,不同的基因型与HBV感染的致病性有一定的相关性。C基因型在重症乙型肝炎患者中为优势基因型[5、9-10],B基因型在无症状HBV携带者中比例较高,约占72.2%[6]。通过对B、C型慢性肝炎患者ALT、AST、TBIL、G 等比较,结果显示C型肝脏损害明显比B型严重,同时根据研究结果可知C型肝炎后肝硬化的发生率比B型高;C型肝细胞癌的发病率较B型高[11]。Lindh[12]等对HBV慢性感染者的基因型及C基因启动子(CP)变异的研究表明,T1762变异更易出现在C基因型,感染C型后更易出现较重的肝脏炎症。Kao[13]等在台湾做了一个较大样本的调查,发现C基因型在肝硬化及年龄大于50岁的病人中的流行率显著高于无症状携带者;年龄分层分析显示,35岁以下的肝癌病人中B型的感染率远远高于无症状携带者;另外,C基因型感染率随年龄的增长而下降。说明c基因型要经过较长时间的免疫清除然后进入较严重的肝脏损害阶段,而B基因型则经过较短的免疫清除进入较轻的病变阶段。从目前的研究来看,HBV C基因型与较重的肝脏病变相关,B型则与较轻的病变相关。

HBV基因型与干扰素的治疗效果有关,与核苷类抗病毒药物疗效的关系还不确定。赵文静[14]等研究血清B、C型HBV感染与临床诊断抗病毒相关性结果揭示了乙型肝炎病毒感染的基因型及不同基因型与诊断治疗的相关性,及拉米夫定对B基因型的治疗优于C型。

从上述研究中可见,HBV C基因型与较重的肝脏病变相关,并且药物治疗效果相对不理想;B型与较轻的病变相关,并且药物治疗效果较HBV C基因型明显。本研究结果表明,邯郸地区HBV感染者中,基因型分布较单一,C基因型(98.1%)占绝对优势,同时存在少量B基因型(0.6%)及B+C混合基因型(1.2%)。由此可给乙型肝炎的临床治疗提供一定的参考依据。邯郸地区基因型单一的原因可能与该地区居民流动性较小有关。另外,急性乙型肝炎患者机体清除HBV作用强,病毒量下降快,而病毒量较低时难以检测出基因型,故本研究中的急性乙型肝炎标本可检出结果者较少。对慢性HBsAg携带者和急性乙型肝炎,还需进一步增加病例样本,以阐明邯郸地区HBV基因型和亚型的分布规律。

[1]Okamoto H,Tsuda F,Sakugawn H,et al.Typ ing hepatitis Bvirus by homology in nucleotide sequence:comparison of sur2face antigen subtypes[J].J Gen Virol,1988,69(Pt 10):2575.

[2]Chan HL,Tsang SW,L iew CT,et al.Viral genotype andhepatitis B virus DNA levels are correlated with histologicalliver damage in HBeAg2negative chronic hepatitisB virus infection[J].Am J Gastroenterol,2002,97(2):406.

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[6]李雅娟,庄 辉,李 杰,等.乙型肝炎病毒基因型和亚型的分布及其与临床的相关性[J].中华肝脏病杂志,2005,13(10):724.

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[9]冯相伟,孟繁平,汪 杨,等.慢性乙型肝炎患者血清HBV基因分型[J].微生物学杂志,2007,2(03).

[10]唐克明,高伏圣,张春林,等.中国安徽地区肝癌组织中HBV基因型的分布研究[J].中国现代医学杂志,2008(12).

[11]区映研,杨海红,曾文铤,等.乙肝病毒基因分型的临床意义[J].广州医学院学报,2005,33(06):26.

[12]Lindh M,Hannoun Dhillon AP,et al.Core promoter mutations and genotypes in relation to viral replication and liver damage in East Asian hepatitis B virus carriers[J].Infect Dis,1999,179(4):775.

[13]Kao JH.Hepatitis B virus genotypes and hepatocellular carcinoma in Japan Reply[J].Gastroenterology,2001,120(3):1564.

[14]赵文静,王波,刘微,等.吉林省血清B、C型HBV感染与临床诊断抗病毒相关性研究[J].吉林医学,2006,27(01):26.

Distribution and clinical significance of hepatitis B virus(HBV)genotypes in HBV-infected patients in handan city

DENG Jian,MAYan-xia,G UO Na-na,et al.(Handan Center forDisease Control and Prevention,Handan056008,China)

ObjectiveTo study hepatitis B virus(HBV)genotype distribution and its clinical significance in HBV-infected patients.MethodsWe used type specific primers andPCR to detect HBV genotype of 180HBV-infected patients.ResultsAmong180 HBV-infected patients,162(90%)can detect the genotype,the other can't.in the 162,1(0.6%)was genotype B,and 2(1.2%)were genotype B+C,and 159(98.1%)were genotype C,and none wasgenotype A、D、E 、F.Conclusionamong HBV-infectedpatients in handan city,genotype C was predominant,and genotype B and genotype B+C were minor.Genotype C may be associated with the severe liver process.

Hepatitis B virus;Genotype;Polymerase chain reaction

R512.6+2

A

1007-4287(2010)01-0059-03

2009-05-11)