五子衍宗汤对环磷酰胺致小鼠生精障碍保护作用的研究*

张长城，贾亮亮，许 佳，孙志伟，曾 晓，何毓敏，袁 丁，王洪武

(三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002)

五子衍宗汤对环磷酰胺致小鼠生精障碍保护作用的研究*

张长城，贾亮亮，许 佳，孙志伟，曾 晓，何毓敏，袁 丁，王洪武△

(三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002)

目的:研究五子衍宗汤对环磷酰胺(CY)所致小鼠生精障碍的保护作用。方法:腹腔注射环磷酰胺建立小鼠生精障碍模型，检测小鼠的睾丸及附睾重量、精子密度、活率，流式细胞术分析睾丸各级生精细胞细胞周期，光、电镜观察睾丸组织学和超微结构的变化。结果:五子衍宗汤能够显著增加模型小鼠的睾丸及附睾重量，增加精子密度，提高精子活率，恢复各级生精细胞百分比;改善环磷酰胺所致模型小鼠睾丸组织的病理性变化。结论:五子衍宗汤可以显著改善环磷酰胺所致的小鼠生殖功能损害。

五子衍宗汤;环磷酰胺;生精障碍

五子衍宗汤由枸杞子、菟丝子、五味子、覆盆子、车前子组成，具有补肾益精、填精补髓的功效，主治肾虚遗精、阳痿早泄、久不生育，在临床上常用于男性不育的治疗，但五子衍宗汤是否具有拮抗环磷酰胺所致生精障碍的药理作用尚未明确。

1 材料与方法

1.1 药物

五子衍宗汤由枸杞子、菟丝子、覆盆子、车前子、五味子组成，全部生药经三峡大学医学院汪鋆植教授鉴定为正品。按照传统方法煎药，浓缩至粉末，提取率为18.8%，临用前配成相应浓度的溶液;注射用环磷酰胺，规格为0.2g，批号08121021，江苏恒瑞医药股份有限公司。

1.2 动物

BalB/c种雄性小鼠，SPF级，8～9周龄，22g～25g，湖北省实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK(鄂)2008-0005。

1.3 试剂

Bouins液:苦味酸饱和水溶液 750mL，甲醛250mL，冰醋酸 50mL。精子营养液:BWW(NaCl 0.554 g/L、KCl0.0356 g/L、CaCl20.025g/L、KH2PO40.0162 g/L、MgSO4·7H2O 0.0294 g/L、NaHCO30.210g/L、NaPyr 0.003g/L、Nalac 0.370g/L、Glucose 0.100g/L、质 量 分 数 0.5% 的 酚 红1.0mL、青霉素10000U、质量分数0.3%的 BSA。其余药品均为分析纯。

1.4 仪器

SQIAS-2000彩色精液质量图文分析仪，武汉千屏影像技术有限责任公司;DMR型多功能显微镜及图像分析系统，德国Leica公司;H-7500型透射式电子显微镜，德国Leica公司;ULTRACUT R型超薄切片机，奥地利莱卡公司;JA2003型电子分析天平，上海天平仪器厂。

1.5 方法

1.5.1 动物模型制备 32只BalB/c雄性小鼠，随机分为4组，依次为空白对照组、模型组、五子衍宗汤低剂量组、五子衍宗汤高剂量组。除空白对照组外，其余小鼠腹腔注射环磷酰胺50mg/kg，连续注射7d，空白对照组腹腔注射等量生理盐水。空白对照组和模型组每天灌服1%羧甲基纤维素钠0.2ml，五子衍宗汤低剂量组给予五子衍宗汤2g/kg，五子衍宗汤高剂量组给予五子衍宗汤4g/kg，各组小鼠连续给药35d。

1.5.2 小鼠生殖器官重量的测定 末次给药24h后称重，处死小鼠取睾丸和附睾并称湿重。

1.5.3 小鼠精子密度及精子活率的测定 将盛有6ml精子营养液［1］的试管置于恒温水浴箱预热至37℃，取单侧附睾去除脂肪，剪碎放入试管中摇匀，37℃保温10min～15min，使精子充分游离，接着取1滴滴入牛鲍氏血细胞计数板上，计算每毫升精子数。用微量移液器吸取10μl精子悬液，利用SQIAS-2000彩色精液质量图文分析仪进行精子活率测定。

1.5.4 小鼠睾丸各倍体生精细胞比例的影响测定 取单侧睾丸去除包膜、剪碎，置于3ml pH 7.4的PBS试管中，于漩涡震荡混合器上混合3min，组织细胞液用200目尼龙网过滤于试管内，1500r/min离心5min，弃上清将沉淀悬浮后加3ml PBS，混匀1min，同样条件重复洗涤2次，制成单细胞悬液。PBS调整细胞浓度至106～107个/ml 4℃、70%乙醇固定2 h后，低速短时离心去除固定液，PBS洗2遍，加 40μg/ml的 RNA 酶 400μl，于 37℃ 水浴 30 min，加入100μl PI染液混匀，4℃避光染色30min即可上机进行检测，计算出不同倍体细胞的百分比。

1.5.5 小鼠睾丸组织形态学及超微结构观察取单侧睾丸石腊切片，HE染色，光镜观察睾丸组织内精原细胞与各级生精细胞的分布情况。环氧树脂包埋，做超微切片，电镜观察睾丸组织内曲细精管及各级生精细胞超微结构的变化。

1.5.6 统计学处理 数据经SPSS 13.0软件处理，实验各个指标均用均数±标准差表示(±s)，各组均数之间比较进行one-way ANOVA检验。

2 结果

2.1 五子衍宗汤对模型小鼠睾丸、附睾重量的影响

表1显示，模型组小鼠睾丸重量和附睾重量显著低于空白对照组，五子衍宗汤低、高剂量均可增加小鼠的睾丸及附睾重，但无显著性差异。

表1 五子衍宗汤对模型小鼠睾丸、附睾重量的影响(±s，n=8)

表1 五子衍宗汤对模型小鼠睾丸、附睾重量的影响(±s，n=8)

注:与模型组比较:*P<0.05，#P<0.01

组别 剂量(g/kg) 睾丸重(g) 附睾重(g)空 白 组 0.100±0.005*0.032±0.001*模 型 组 0.076±0.013 0.027±0.003五子衍宗汤低剂量组 2 0.087±0.010 0.028±0.002五子衍宗汤高剂量组4 0.089±0.014 0.029±0.002

2.2 五子衍宗汤对模型小鼠精子密度及精子活率的影响

表2显示，模型组小鼠精子密度、精子活率显著低于空白对照组。五子衍宗汤低、高剂量均可显著增加生精障碍小鼠的精子密度。五子衍宗汤低、高剂量对生精障碍小鼠的精子活率也有一定的提升作用。

表2 五子衍宗汤对模型小鼠精子密度及精子活率的影响(±s，n=8)

表2 五子衍宗汤对模型小鼠精子密度及精子活率的影响(±s，n=8)

注:与模型组比较:*P<0.05， P<0.01

组别 剂量(g/kg) 精子密度(106/ml) 精子活率(%)空 白 组91.25±13.08 67.00± 7.78模 型 组 28.31±5.64 37.13±11.51五子衍宗汤低剂量组 2 61.68±12.23 45.14±13.13*五子衍宗汤高剂量组 4 62.12±25.94 49.00± 7.62*

2.3 五子衍宗汤对模型小鼠睾丸生精细胞周期的影响

表3显示，模型组小鼠1C和4C细胞百分比显著下降，2C细胞百分比相对升高。五子衍宗汤低、高剂量均可显著增性恢复生精障碍小鼠各级生精细胞的百分比。

表3 五子衍宗汤对模型小鼠睾丸生精细胞周期的影响(±s，n=8)

表3 五子衍宗汤对模型小鼠睾丸生精细胞周期的影响(±s，n=8)

注:与模型组比较:*P<0.05， P<0.01

组别 1C(%) 2C(%) 4C(%)空 白 组52.45±3.17 15.78±1.53 25.46±1.79模 型 组 29.82±1.72 25.08±1.51 16.62±2.07五子衍宗汤低剂量组 40.46±4.73 17.16±1.90 21.91±1.45*五子衍宗汤高剂量组 46.00±0.66 17.60±2.25 18.35±2.45

2.4 五子衍宗汤对模型小鼠睾丸组织形态学的影响

光镜可见，模型组小鼠睾丸内生精小管多退化、萎缩，管壁生精上皮变薄，生精细胞层数减少，排列紊乱，精子细胞较少，腔内精子少见，睾丸生精小管间隙明显增大。五子衍宗汤组小鼠睾丸内大部分生精小管的各级生精上皮细胞层次较明显，排列较规则，管腔内可见较多成熟精子生成，基本达到正常的睾丸组织形态(结果见图1)。

图1 五子衍宗汤对模型小鼠睾丸组织形态学的影响(HE×200)

2.5 五子衍宗汤对模型小鼠睾丸组织超微结构的影响

电镜下可见，模型组小鼠睾丸生精细胞较少，并可见明显的生精细胞凋亡;治疗组睾丸超微结构明显恢复，五子衍宗汤组可见生精上皮变厚，见正常形态的精原细胞、精母细胞且生精上皮的中部有爆发产出的大量精子(结果见图2)。

图2 五子衍宗汤对模型小鼠睾丸组织超微结构的影响

3 讨论

环磷酰胺是一种临床常见的抗肿瘤药物，其机制主要是通过对DNA的烷化作用而干扰细胞内多种生物学功能。近代研究表明，环磷酰胺具有明显的生殖毒性，对睾丸有明显的损伤作用，导致无精子症或少精子症，造成不育［2］。通过临床研究发现，在儿童期因白血病、实体肿瘤、自身免疫性疾病接受环烷化剂环磷酰胺治疗的男性患儿，成年后80.2%～92.6%为无精子症或少精子症，可导致不育或者出现子代遗传性缺陷或畸形［3］。中医药对生精障碍有较好的治疗效果，但对环磷酰胺所致生精障碍的治疗仍缺乏深入的研究。五子衍宗汤为临床治疗男性不育的常用方剂，本实验探讨了五子衍宗汤对环磷酰胺致小鼠睾丸功能损害及生精障碍的保护作用。

本研究发现，在环磷酰胺致生精障碍小鼠模型中，小鼠睾丸重量、附睾重量、精子密度、精子活率等显著下降，生精小管退化萎缩，生精上皮层次减少，细胞排列紊乱，初级精母细胞(4C细胞)与精子细胞和精子(1C细胞)比例显著减少。五子衍宗汤能够拮抗环磷酰胺的生殖毒性，提高睾丸和附睾重量;显著增加生精障碍小鼠的精子密度及精子的活率;修复睾丸生精小管生精上皮损伤，使生精小管结构基本恢复正常;促进精原细胞向初级精母细胞转化，恢复各级生精细胞的比例。

睾丸是精子的生成场所，附睾则对精子的成熟起重要作用。研究结果提示，五子衍宗汤通过修复生精上皮，改善生精小管微环境，促进精子的形成和受损睾丸的修复，从而拮抗环磷酰胺导致的生精障碍，恢复其生殖功能。本实验初步探讨了五子衍宗汤对环磷酰胺致小鼠生精障碍的保护作用，为五子衍宗汤在临床上进一步应用奠定了基础。

［1］陈德宇，刘丽敏，谢庆东，等.抗精液抗体对精子线粒体功能的影响［J］.汕头大学医学院学报，2008，21(1):4-6.

［2］代江涛，李旭良，魏光辉.环磷酰胺对睾丸组织端粒酶活性表达的影响及意义［J］.中华小儿外科杂志，2007，28(1):31-32.

［3］Gatta G，Capocaccia R，ColemanMP，et al.Childhood cancer survival in Europe and the United States［J］.Cancer，2002，1995(8):1767-1772.

R285.5

B

1006-3250(2010)07-0570-02

国家自然科学基金资助项目(30973928)

2009-12-28

张长城(1973-)，男(土家族)，湖北长阳人，副教授，医学博士，硕士研究生导师，从事中药药理学和中医药防治男科疾病机制研究。

△通讯作者:王洪武。Tel:0717-6397198，E-mail:hongwuang@126.com。