灵芝颗粒质量标准研究

2010-09-10 05:13薛强李卿秦剑肖铭玉重庆医科大学附属第二医院重庆市400010重庆市中药研究院重庆市400065
中国药房 2010年39期
关键词:乙素甲素三氯甲烷

薛强,李卿,秦剑,肖铭玉(1.重庆医科大学附属第二医院,重庆市 400010;.重庆市中药研究院,重庆市 400065)

灵芝颗粒质量标准研究

薛强1*,李卿2,秦剑2,肖铭玉2(1.重庆医科大学附属第二医院,重庆市 400010;2.重庆市中药研究院,重庆市 400065)

目的:建立灵芝颗粒的质量标准。方法:采用薄层色谱(TLC)法对方中灵芝、柴胡进行定性鉴别;采用高效液相色谱法测定五味子中五味子甲素、五味子乙素含量。结果:TLC斑点清晰,分离度好,阴性对照无干扰;五味子甲素进样量、五味子乙素进样量分别在0.060~0.60、0.082~0.82µg范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系(r分别为0.999 6、0.999 5);平均回收率分别为99.02%、99.06%,RSD分别为0.45%(n=6)、0.48%(n=6)。结论:定性定量方法快速、准确、专属性强,所建标准可用于灵芝颗粒的质量控制。

灵芝颗粒;薄层色谱法;高效液相色谱法;灵芝;柴胡

灵芝颗粒是由灵芝、五味子、柴胡、郁金等4味药材制成的纯中药制剂,具有保护肝脏、降低谷丙转氨酶和退黄作用,用于治疗急性传染性黄疸肝炎、迁延性肝炎、慢性肝炎、单项谷丙转氨酶高等症。为有效监测制剂质量,笔者对该产品的质量标准进行了研究,用薄层色谱(TLC)法对制剂中的灵芝、柴胡进行定性鉴别;采用高效液相色谱(HPLC)法测定五味子中有效成分五味子甲素、五味子乙素的含量。

1 仪器与材料

LC-2010型HPLC仪(日本岛津公司);二极管阵列紫外检测器(上海顾村电光仪器厂);AE-240S型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);薄层色谱成像仪(瑞士卡玛公司)。

五味子甲素、五味子乙素、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d对照品,灵芝、柴胡对照药材(中国药品生物制品检定所,批号分别为110764-200107、110765-220205、110857-200405、110778-200404、120968-200203、0992-200102);灵芝颗粒(重庆市中药研究院自制,批号:091001、091101、091102);各阴性样品均由重庆市中药研究院中药化学室提供;乙腈为色谱纯,水为去离子水,其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 灵芝的TLC鉴别

取本品2 g,研细,加乙醇30 mL,加热回流30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇3 mL使溶解,作为供试品溶液;另取灵芝对照药材1 g,同法制成对照药材溶液;另取缺灵芝阴性样品2 g,同法制成缺灵芝阴性对照溶液。照TLC法[1]试验,吸取上述3种溶液各5µL,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以石油醚(60~90℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,置于紫外光灯(365 nm)下检视。结果,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的荧光斑点;阴性对照无干扰。灵芝的TLC见图1。

2.2 柴胡的TLC鉴别

取本品3 g,研细,加甲醇30 mL,加热回流1 h,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液;另取柴胡对照药材0.5 g,加甲醇20 mL,同法制成对照药材溶液;再取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d对照品,加甲醇制成每1 mL各含0.3 mg的溶液,作为对照品溶液;另取缺柴胡阴性样品3 g,同法制成缺柴胡阴性对照溶液。照TLC法[1]试验,吸取上述溶液各10µL,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1,饱和10 min)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液,加热至斑点显色清晰。结果,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的斑点;阴性对照无干扰。柴胡的TLC见图2。

图1 灵芝的TLC1.供试品;2.灵芝对照药材;3.缺灵芝阴性对照Fig 1 TLC of Ganoderma1.test sample;2.Ganodermareferencesubstance;3.negative control without Ganoderma

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件及系统适用性试验色谱柱:Symmetry ODS C18(150 mm×4.6 mm,5µm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)(梯度洗脱 :0~8 min,A 的 体 积 分数 为55%;8~22 min,A的体积分数为55%~64%);流速:1.0 mL·min-1;柱温:25℃;检测波长:254 nm。理论板数按五味子甲素色谱峰计算应不低于3 000,五味子甲素、五味子乙素与相邻峰的分离度>1.5。色谱见图3。

2.3.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品,研细,取约2.0 g,精密称定,置于索氏提取器中,加三氯甲烷60 mL,回流提取4 h,回收三氯甲烷至适量,加硅胶1.5 g,搅拌均匀,干燥,置于硅胶柱(100~200目,1.5 g,内径1 cm)上,用三氯甲烷40 mL洗脱,收集三氯甲烷液,蒸干,残渣用甲醇适量使溶解,加甲醇定容至25 mL,摇匀,过滤,即得。

图2 柴胡的TLC1.供试品;2.柴胡对照药材;3.缺柴胡阴性对照;4.柴胡皂苷a对照品;5.柴胡皂苷d对照品Fig 2 TLC of Bupleuri Radix1.testsample;2.Bupleuri Radix reference substance;3.negative control without Bupleuri Radix;4.saikosaponin a;5.saikosaponin d

图3 高效液相色谱图A.混合对照品;B.供试品;C.缺五味子阴性对照;1.五味子甲素;2.五味子乙素Fig 3 HPLC chromatogramsA.mixed control substance;B.test sample;C.negative control without Schisandrae Chinensis;1.deoxyschizandrin;2.γ-Schisandrin

2.3.3 混合对照品溶液的制备 精密称取五味子甲素、五味子乙素对照品适量,加甲醇制成每1 mL含五味子甲素30µg、五味子乙素41µg的混合溶液,即得。

2.3.4 缺五味子阴性对照溶液的制备 取按处方比例及制备工艺制备的不含五味子的阴性样品,按“2.3.2”项下方法制得缺五味子阴性对照溶液。

2.3.5 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液2、5、10、15、20µL,按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。以峰面积积分值(A)为纵坐标,进样量(C,µg)为横坐标,进行线性回归,得五味子甲素、五味子乙素的回归方程分别为A=1 124 602C-4 955.33(r=0.999 6)、A=1 351 247C-5 524.26(r=0.999 5)。结果表明,五味子甲素、五味子乙素进样量分别在0.060~0.60、0.082~0.82µg范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。

2.3.6 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10µL,按“2.3.1”项下色谱条件重复进样6次,测定峰面积。结果,五味子甲素、五味子乙素的RSD分别为0.66%(n=6)、0.85%(n=6),表明仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性试验 精密称取样品1份,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,照“2.3.1”项下色谱条件分别于0、4、6、10、14 h进样测定。结果,五味子甲素、五味子乙素的RSD分别为0.94%(n=5)、1.20%(n=5),表明供试品溶液在14 h内稳定。

2.3.8 重复性试验 精密称取同批样品6份,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,照“2.3.1”项下色谱条件测定。结果,五味子甲素、五味子乙素的RSD分别为1.10%(n=6)、0.94%(n=6),表明方法重复性良好。

2.3.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的同批样品6份,分别精密加入五味子甲素、五味子乙素,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,照“2.3.1”项下色谱条件测定,计算加样回收率,结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)Tab 1Results of recovery test(n=6)

2.3.10 样品含量测定 取各批次灵芝颗粒,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,照“2.3.1”项下色谱条件测定。结果,3批(批号:091001、091101、091102)灵芝颗粒中每袋分别含五味子甲素1.26、1.64、1.54 mg,含五味子乙素1.95、2.21、2.14 mg。

3 讨论

对本制剂中灵芝、柴胡进行TLC鉴别研究,均以阴性样品为对照。结果表明,各TLC斑点不受样品中其它成分的干扰,专属性强、重复性好,可作为本制剂质量控制检测指标。

本制剂由多味药材提取制成,故对供试品溶液的提取方法(甲醇超声提取法、甲醇回流提取法、三氯甲烷超声提取法、三氯甲烷回流提取法)进行比较。结果,甲醇提取法干扰较大,三氯甲烷超声提取法含量偏低,而三氯甲烷回流提取法操作简便,含量测定结果比较满意;由于成分复杂,采用硅胶柱除杂,效果明显,杂质量大大减少,提高了色谱柱分离效果。

文献报道[2~5],五味子成分的分析多采用乙腈-水体系,但分离时间长,效果不理想;笔者经反复考察,采用乙腈-磷酸水溶液梯度洗脱,效果明显。在此条件下,样品分离很好,可用于灵芝颗粒的质量控制。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)[S].2005年版.北京:化学工业出版社,2005:229、附录31.

[2]窦志华,丁安伟,施 忠.反相高效液相色谱法测定复方五仁醇胶囊中2组分的含量[J].中国药房,2007,18(3):198.

[3]宣东平,窦志华,尤蝠仪.高效液相色谱法测定五味子浸膏中五味子醇甲与五味子乙素的含量[J].时珍国医国药,2008,19(3):555.

[4]张立升,富玉海,吕文军.HPLC法测定保肝胶囊中五味子乙素的含量[J].中国药事,2007,21(6):424.

Study on Quality Standard of Lingzhi Granules

XUE Qiang(The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400010,China)
LI Qing,QIN Jian,XIAO Ming-yu(Chongqing Academy of Chinese Materia Medica,Chongqing 400065,China)

OBJECTIVE:To establish the quality standard of Lingzhi granules.METHODS:The qualitative identification of Ganoderma and Bupleuri Radix was carried out by TLC.The content of deoxyschizandrin and γ-Schisandrin inSchisandra chinensiswas determined by HPLC.RESULTS:The TLC sports were fairy clear and separated well without interference of negative sample.The linear ranges were 0.060~0.60 µg for deoxyschizandrin(r=0.999 6),0.082~0.82 µg for γ-Schisandrin(r=0.999 5),respectively.The average recoveries were 99.02%(RSD=0.45%,n=6)and 99.06%(RSD=0.48%,n=6).CONCLUSION:The method is rapid,accurate and specific.It can be used for the quality control of Lingzhi granules.

Lingzhi granules;TLC;HPLC;Ganoderma;Bupleuri Radix

R283.627;R927.1

A

1001-0408(2010)39-3722-03

*主治医师,博士。研究方向:肝胆胰脾疾病。E-mail:kevin-999999@21cn.com

2010-03-07

2010-08-27)

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