左旋四氢巴马汀对大鼠海马神经元细胞钙超载损伤的保护作用

周亚光,苏明华,杨光田

缺血性神经细胞损伤与细胞内过高的钙离子水平密切相关。临床上常通过抑制神经细胞内的钙超载、维持细胞内的钙稳态来控制和治疗脑缺血性损伤。左旋四氢巴马汀(L-tetrahydmpalmatine,l-THP)为中药延胡索的主要成分延胡索乙素的左旋物。近年研究表明左旋四氢巴马汀具有抗脑缺血再灌注损伤[1,2]、抗心律失常[3]、钙拮抗[4]等作用。本实验通过建立药物诱导细胞钙超载损伤模型,应用激光扫描共聚焦显微镜技术,观察l-THP对海马神经细胞中胞浆游离钙的影响,并探讨其保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组 乳鼠(出生1 d～2 d),雌雄兼用。由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。分为4组:空白对照组,l-THP 1μmol/L组,1-THP 10μmol/L组,1-THP 100 μmol/L组。

1.2 药品和试剂 l-THP购自广东省博罗先锋药业集团有限公司,溶于蒸馏水中配成l mmol/L母液,每次实验时,把母液溶于D-HANKS液中,配成实验所需浓度。Fluo-3/AM购自Sigma公司,用二甲基亚砜配成保存液,储存于-20℃冰箱中。B27、多聚赖氨酸、Caffeine均购于 Sigma公司,胎牛血清、马血清、DMEM/F12培养基为Gibco公司产品,其余试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器 激光扫描共聚焦显微镜系统InsightPlus(美国Meridian公司);Olympus IX-70倒置显微镜(Japan)。

1.4 新生大鼠海马神经元培养[5]新生乳鼠冷冻麻醉后,无菌条件下分离海马并置入冰冷D-HANKS液中。将细胞悬液滴在预先用50μg/mL多聚赖氨酸(Sigma,USA)包被的玻片上,并放入 35 mm培养皿中。于37℃ 、饱和湿度、5%CO2、95%空气条件下培养,24 h后换维持培养基(DM EM/F12+B27培养基),然后每周换液 2次。于培养第5天加入 3μg/mL阿糖胞苷作用48 h,以抑制胶质细胞等非神经元的生长。

1.5 海马神经元胞内钙浓度([Ca2+]i)变化测定[6]于培养第7天时,将分离的细胞从维持培养基中换到标准人工脑脊液(ACSF液)中。随后将海马神经元细胞置于Fluo-3/AM(20 Umol/L的负载液中,于37℃孵育30 min。去除负载液,并洗涤3次。在光镜下找到形态完整,突触清晰的细胞,对其进行激光扫描测定。Fluo-3/AM被动扩散进入细胞后,被酯酶水解释出Fluo-3,Fluo-3与Ca2+结合,受488 nm的激光激发而产生荧光,其荧光值与[Ca2+]i呈正相关,即以荧光值变化表示[Ca2+]i变化。在激光扫描共聚焦显微镜time series程序下对细胞XY平面进行扫描,间隔时间为2 s,共扫描120次。计算细胞XY平面内平均荧光强度,以平均荧光强度代表[Ca2+]i,以荧光值增高或下降百分比来衡量细胞内Ca2+含量变化。

2 结 果

2.1 1-THP对静息状态下[Ca2+]i的影响 将 Fluo-3/AM 标记的细胞置于标准人工ACSF中,于扫描第2次和第3次之间加入不同浓度的1-THP,对照组加入相同体积的生理盐水。结果显示应用1-THP,各加药组的钙荧光强度值与对照组比较无统计学意义。详见表1。

表1 静息状态下各组神经元细胞的钙荧光强度值(±s)

表1 静息状态下各组神经元细胞的钙荧光强度值(±s)

组别 0 s 50 s 100 s 150 s 200 s 240 s Control 973.6±7.8 976.2±10.6 968.9±17.3 976.9±14.0 970.0±9.5 971.9±11.2 l-THP 1μmol/L 973.4±10.2 964.3±14.8 972.4±10.3 967.8±8.6 965.1±9.8 968.8±7.8 l-THP 10μmol/L 975.1±7.8 968.3±7.8 970.5±5.1 970.4±9.7 967.1±10.7 972.0±16.3 l-THP 100μmol/L 972.9±5.7 973.3±3.8 974.8±8.1 973.8±5.5 973.3±6.7 976.2±5.5注:与对照组比较 P＞0.05。

2.2 1-THP对KCl去极化致[Ca2+]i升高的影响 在盛有标准ACSF液的浴槽中加入标记细胞和相应浓度1-THP,对照组加入相同体积的生理盐水。温浴5 min后,开始扫描,并在第2次和第3次扫描之间加入终浓度为60 mmol/L的KCl,结果:对 照组 、lμmol/Ll-THP 、10μmol/Ll-THP 、100μmol/L l-THP峰值荧光强度增加,分别为(64.3±2.8)%、(46.3±3.1)%、(34.2±1.5)%、(20.8±1.2)%(n=6,P＜0.01)。l-THP对KCl引起的胞浆[Ca2+]i升高有抑制作用。

2.3 1-THP对咖啡因致神经元细胞胞浆钙浓度升高的影响无钙ACSF液(其配方中CaCl2,用EGTA代替)中加入标记细胞和相应浓度1-THP扫描,对照组加入相同体积的生理盐水。温浴5 min后,开始扫描,于扫描第2次与第3次之间加入10 mmol/L Caffeine。 结 果 对 照 组、lμmol/Ll-THP、10 μmol/L l-THP、1 00μmol/Ll-THP峰值荧光强度增加 ,分别为(53.9±4.3)%、(48.2±3.9)%、(44.3±4.6)%、(35.5±3.2)%(n=6,P＜0.05)。l-THP对 Caffeine引起的胞浆[Ca2+]i升高有抑制作用。

3 讨 论

神经元胞内 Ca2+超载是缺血性脑损伤的关键因素[7,8]。缺血引起胞浆[Ca2+]i的增加来自于细胞外Ca2+内流,细胞内储存Ca2+释放以及胞浆Ca2+的外排能力下降。当Ca2+内流过多或胞内储存Ca2+释放过多,超出神经元对Ca2+的调节能力时,引起钙超载。钙超载可以通过激活氧化应激反应产生氧自由基、引起线粒体损伤以及激活蛋白激酶等三种途径引起神经元死亡[9]。因此,预防损伤引起的细胞内钙超载,能有效地防治缺血性脑损伤。

本实验采用的2种神经元损伤模型均属药物诱导的钙超载损伤模型。①过量KCl可使细胞去极化,开放电压依赖性钙通道引起细胞内钙超载。②高浓度咖啡因可在细胞外无钙的环境下,刺激神经细胞内的兰尼啶受体(Ry R)调控的钙池,引起胞内钙的释放,造成细胞损伤。对于两种钙超载模型。本研究运用激光扫描共聚焦显微镜技术动态、定量地研究了左旋四氢巴马汀对海马神经元细胞钙超载的影响。结果显示(1～100)μmol/L1-THP对静息状态下的细胞内钙无影响,说明它不参与自发的外钙内流和内钙释放,不影响静息状态下的细胞功能。低浓度的1-THPμmol/L可轻微抑制由KCl诱导的内钙增多;当增加1-THP达100μmol/L时,可显著抑制由KCl诱导的细胞内钙增加,这种抑制作用与左旋四氢巴马汀剂量有关。另外,当用Caffeine刺激细胞内钙库时,左旋四氢巴马汀可抑制细胞的内钙增多。因此,推测左旋四氢巴马汀对两种类型的神经元损伤模型所导致的钙超载,均有保护作用。即不仅抑制电压依赖性钙通道开放所致的钙内流,而且对钙库释放钙也有影响。由于左旋四氢巴马汀对KCl诱导的钙超载的抑制程度强于Caffeine刺激细胞内钙库诱导的钙超载,表明电压门控型钙通道对左旋四氢巴马汀的作用更敏感。

尽管本实验发现左旋四氢巴马汀能够通过作用于电压门控型钙通道和细胞内兰尼啶受体(Ry R)调控的钙池,来减轻损伤诱导的神经元细胞内钙超载。但由于中枢神经系统神经元膜上已成功地记录出了 L、N、P、Q、R、T等 6种类型的电压依赖型钙通道,它们有各自不同的电生理学特征。左旋四氢巴马汀具体作用于那种类型的电压依赖型钙通道以及如何干预这些电压依赖型钙通道还不清楚,仍需进一步的实验研究证实。

[1]陈燕启,刘德红,杨光田.左旋四氢巴马汀抗脑缺血再灌注损伤之作用研究[J].中国全科医学,2004,7(10):713-715.

[2]邓普珍,汤彦,杨光田,等.左旋四氢巴马汀在大鼠脑缺血-再灌流时对神经元凋亡的影响[J].中华急诊医学杂志,2001,10(6):386-388.

[3]刘玉梅,周宇宏,单宏丽,等.延胡索乙素对豚鼠单个心室肌细胞钾离子通道的影响[J].中国药理学通报,2005,21(5):599-601.

[4]Huang K,Dai GZ,Li XH,et al.Blocking L-calcium cur rent by l-tetrahydropalmatine in single ventricular myocyte of guinea pigs[J].A cta Pharmacol Sin,1999,20(10):907-911.

[5]杨雷,张树卓,李玉荣,等.新生大鼠海马神经元的原代培养方法[J].哈尔滨医科大学学报,2002,36(5):390-391.

[6]李楠,王俊玫,杨军.激光扫描共聚焦显微镜测定细胞内游离钙的方法[J].中国体视学与图像分析,1997,2(3):188-191.

[7]Peter L.Ischemic cell death in brain neurons[J].Physiol Rev,1999,79(4):l432-1568.

[8]Nakamura T,Minamisawa H,Katayama Y,et al.Increased intracellular Ca2+concentration in the hippocampal CA1 area during global ischemia and reperfusion in the rat:A possible cause of delayed neuronal death[J].Neuronscience,1999,88(1):57-67.

[9]Arundine M,Tymianski M.Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity[J].Cell Calcium,2003,34(4-5):325-337.