乳酸菌胞外多糖生物合成与遗传调控研究进展

赵时玮，任 静，王荫榆，吴正钧，郭本恒

（1.上海海洋大学食品学院，上海201306；2.光明乳业股份有限公司技术中心，上海200436）

自然界中有多种微生物可以产生细胞外多糖（exopolysaccharides，EPS），根据这些多糖在细胞的相对位置，分为以黏液形式分泌到外界环境中的黏液多糖（secreted polysaccharides，EPS）或仍然紧密粘附在细胞表层形成荚膜的荚膜多糖（capsular polysaccharides，CPS）以及与 O- 抗原相关的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）。而术语EPS通常用来描述前2种多糖[1]。

自20世纪40年代Gronwall成功开发出由肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）发酵生产右旋糖酐（dextran）作为代血浆的主要成分以来，世界范围内微生物胞外多糖的研究与开发已成为工业微生物研究的热点之一[2]。乳酸菌（Lacticacid bacteria，LAB）是一类能发酵、可利用碳水化合物并产生大量乳酸的细菌。其所产胞外多糖因其良好的流变学特性，被认为是一种食品安全级的天然增稠剂、稳定剂。随着多糖抗肿瘤、抗瘘管、免疫调节、降胆固醇或调节血压等生物学活性相关研究的报道[3-4]，人们对乳酸菌胞外多糖的应用引起了极大关注。但乳酸菌胞外多糖的产量低，制约着它的大规模工业化应用。有学者尝试通过筛选乳酸菌优良菌株及优化培养条件来提高其胞外多糖的产量[5-7]，但效果不明显。随着对细菌多糖生物合成遗传途径研究的增多和分子生物学技术的迅速发展，越来越多的学者期望利用基因工程方法调控多糖合成代谢来改变多糖产量和结构，以期获得稳定高产的优良菌株。笔者就与乳酸菌胞外多糖产生紧密相关的多糖生物合成途径、遗传调控以及有关控制多糖产量与结构的研究状况进行简要叙述。

1 产EPS乳酸菌介绍及胞外多糖的分类

按伯杰氏细菌学手册（8版）中的生化及形态分类法，乳酸菌分为18个属。目前，对其中的乳杆菌属（Lactobacillus）、链球菌属（Streptococeus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、乳球菌属（Lactococcus）等乳酸菌的胞外多糖研究较多。

除肠膜明串珠菌属所产右旋糖酐外，目前研究的大多数产胞外多糖的乳酸菌来自于乳制品，也能从发酵肉制品中分离到。常见的乳品工业生产菌如德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lb del bruecckiissp bulgaricus）、瑞士乳杆菌（Lb helveticus）、干酪乳杆菌干酪亚种（Lb caseissp casei）、酒样乳杆菌（Lb kefiranofaciens）、嗜酸乳杆菌（Lb acidophilus）、嗜热链球菌（S thermophilus）、乳酸乳球菌乳脂亚种（Lc lactisssp cremoris）、乳酸乳球菌（Lc lactis）、肠膜明串珠菌（Leuc mesenteroides）等均能产胞外多糖[8]。其中，研究最多的有嗜热链球菌 SFI6，EU20，NCFB2393，IMDO 01，SFI39，SFI12；保加利亚乳杆菌（Lb bulganicus）筛选菌株 L bulganicus CNRZ 397，CNRZ 1187，CNRZ 416，LB1，LY03等；乳酸乳球菌乳脂亚种（lactococcus lactis subsp cremoris）筛选菌株NIZO B35，NIZOB40，NIZOB891 等[9]。

乳酸菌的EPS根据其所在位置，分为荚膜多糖和黏液多糖。从化学组成上讲，胞外多糖又进一步分成2种类型，一种是同型多糖（homopolysaccharides，HoPS），其构成单位只有一种糖单体，如葡聚糖（肠膜明串珠菌（leuconostoc mensenteroide）主要产生α-D葡聚糖）、果聚糖（唾液链球菌（S salivarius）主要产生β-果聚糖）、甘露聚糖等；另一种是异型多糖（heteropolysaccharides，HePS），由几种不同的糖单体共同组成糖单元进一步连接而成。通常组成乳酸菌胞外多糖的糖单体包括葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、海藻糖、N-乙酰半乳糖胺（Glc-NAc）和乙酰半乳糖（GalNAc）等。

2 EPS生物合成分析

到目前为止，关于细菌胞外多糖的生物合成机制分同型多糖的合成和异型多糖的合成。同型多糖合成由细胞外的糖基转移酶将细胞外的单糖转移至糖链上，而异型多糖的合成主要是由细胞内糖基转移酶催化多个糖基核苷酸进一步聚合输出细胞外合成。

2.1 糖基核苷酸的合成

各种糖基以磷酸化状态或自由态进入细胞内，以自由态进入的糖基需经过磷酸化之后才能进行下一步的酵解。磷酸化后的糖基，一部分进行糖的酵解生成乳酸及其他酸，另一部分则参与胞外多糖的合成。其中，6-P-葡萄糖在磷酸变位酶（phosphoglucomutase，pgm）作用下生成的 1-P-葡萄糖最为关键，1-P-葡萄糖作为中心代谢物，通过一系列的酶作用生成合成多糖的前体：UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖醛酸、dDTP-鼠李糖[10]（图1）。

图1中，箭头上方为编码各相关酶的基因符号：pgm，葡萄糖磷酸变位酶；rfbA，1－磷酸－葡萄糖胸苷基转移酶；galU，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶；rfbB，dTDP- 葡萄糖 -4，6 脱氢酶；galE，UDP-半乳糖差向异构酶；ugd，UDP-半乳糖脱氢酶；rfbC，dTDP-4-酮基－6－脱氧基－D－葡萄糖－3，5变构酶；rfbD，dTDP-4-酮基－L鼠李糖还原酶。

此外，还有以6-P-果糖为中心生成UDP-N-乙酰半乳糖胺和GDP－果糖的代谢途径。上述生成的糖基核苷酸即被作为胞外多糖合成的前体来利用。值得注意的是，这些编码胞外多糖前体合成的关键酶的基因称为持家基因（House Keeping Gene），研究这些基因的表达与多糖产量和结构之间的关系，可为利用基因工程方法提高胞外多糖的生物合成量奠定基础。

2.2 EPS生物合成机制

按合成模式的不同，胞外多糖分为细胞壁外同型多糖的合成与细胞膜上异型多糖的合成，同型多糖的合成为不依赖脂中间载体C55-lipid-p（糖基载体是十一聚类异戊二烯醇磷酸酯，含有55个C原子，故用C55-lipid-p表示）的合成模式，异型多糖的合成则为依赖C55-lipid-p的合成模式。

2.2.1 同型多糖的合成特点 特异性底物不进入细胞，而是在胞外酶的作用下直接将底物中的糖基聚合成胞外多糖，合成过程不依赖糖基核苷酸和C55等物质。

乳酸菌所产同型多糖要么只含有D－果糖，要么只含D－葡萄糖。这些果聚糖和葡聚糖有一个共同特点，都利用细胞外转糖基酶（transglycosylase）以蔗糖为糖基（果糖和葡萄糖）供体合成。合成反应发生在细胞壁，首先糖基启动自身多聚化反应，然后在葡聚糖糖基酶的作用下继续转移糖基进行链的延伸，进一步聚合输出。如肠膜明串珠菌右旋糖酐（dextran）等属于这种模式[11]。

2.2.2 异型多糖的合成特点 异型胞外多糖的生物合成是底物进入细胞，在胞内形成糖基单位；糖基核苷酸在糖基转移酶的作用下将糖基顺序性转至C55脂载体上形成寡糖重复单位，随后C55将重复单元运往膜外，释放并转移到受体聚合胞外多糖。C55的循环运载使胞外多糖链延长。噬热链球菌、乳杆菌、乳球菌等所产异型多糖的合成就属于这种模式。

具体而言，胞外多糖生物合成途径主要是：首先，糖类底物通过主动转运进入细胞，接着基团转位包括底物磷酸化。然后底物一部分进入代谢途径，另一部分进行多糖的生物合成。UDP－葡萄糖焦磷酸化酶诱导1－磷酸葡萄糖变构生成关键前体之一的UDP－葡萄糖。随后通过各种糖基转移酶（Glycosyltransferase，GTF）将各单糖从糖基核苷酸上顺序性转移而装配到脂类载体上形成重复单元，接着这些重复单元在聚合酶的作用下进一步聚合在细胞表面，并且输出至细胞外形成胞外多糖[12]。目前，有很多种EPS结构已被鉴定，如乳酸菌中的链球菌（Streptococcus）、乳球菌（Lactococcus）、乳杆菌（Lactobacillus）。尽管这些EPS组成很少表现出共同特性，但各种属乳酸菌由重复单元组成的多糖的生物合成途径基本相同，甚至和LPS的O-抗原以及一些CPS的生物合成途径也很相似。

2.3 EPS的基因调控

从遗传学角度分析，胞外多糖的生成由一大簇基因编码，位于染色体或质粒上，基因簇通常是单向排列，转录成单个多顺反子mRNA，并协调表达。近年来，越来越多的细菌中参与EPS生物合成的基因簇被克隆和鉴定，其中包括参与革兰氏阴性菌的EPS，例如参与黄原胶（xanthan）等合成的基因簇，以及参与革兰氏阳性菌如乳酸菌EPS合成的基因簇。通过与胞外多糖合成相关基因的同源性比较，发现乳酸菌胞外多糖的合成相关基因与革兰氏阴性细菌胞外多糖相关基因具有高度相似性。尽管有些基因簇涉及特殊糖基核苷酸合成的基因，编码特异糖基转移酶，但通常产糖基因簇主要分4个区域，即位于5′端的控制基因簇转录的调控区域、编码各糖基转移酶的区域、编码决定多糖链长度的区域、编码控制糖单元聚合输出的区域[13]。这里挑选较有代表意义的L lactis ssp cremoris NIZO B40[14]和S thermophilus Sfi6[15]的产糖基因簇进行简单的介绍（图 2）。

目前，L lactis ssp cremoris NIZO B40上调控EPS的基因簇研究最为明确，该菌株包含1个4 2 kb的质粒，上面有1段12 kb的epsRXABCD EFGHIJKL控制多糖合成的操纵子（图2-A）。

图2-A中，epsR片段与表达基因簇的调控蛋白有关。epsA与epsB决定多糖链长度。epsDEFGH调控糖基转移酶的产生，epsI和epsK分别与控制聚合和输出的蛋白有关。epsX，epsC，epsJ，epsL 功能未知。

其中，起始糖基核苷酸转移酶（priming glucosyltransferase）即将UDP-葡萄糖中的葡萄糖转运到脂载体上，构成多糖主链骨架的起始转移酶由epsD编码，为胞外多糖生物合成的第1步，它在基因工程中具有重要的意义。例如Dabour等发现将L lactis subsp cremoris SMQ-461产EPS控制基因编码起始糖基转移酶的片段打断，导致了不产多糖突变株的出现[16]。

特别的是，在某些噬热链球菌多糖基因簇中还有特殊的基因片段。从图2-B可知，S thermophilus Sfi6多糖基因簇5′段之前有一deoD基因，与嘌呤核苷酸磷酸化酶具有高度同源性，推测与核苷酸的合成和降解有关。另外，某些菌株胞外多糖基因簇3′末端有orf14.9，并证明其下游仍存在编码序列，起到编码糖基转移酶或编码与跨膜转运相关蛋白的作用[17-18]。

3 多糖改造工程

3.1 EPS结构改造

研究表明，多糖黏度大小与多聚物分子质量有关，而胞外多糖分子质量由组成糖基重复单元的单糖种类和数量决定。目前，作为功能性食品级的多糖，要求多糖聚合物溶液在单位体积下具有较高浓度和黏稠度[13]，因此人们期望通过多糖聚合物由较高键能的糖苷键以及更多的重复单元连接来达到改善多糖功能性的目的。胞外多糖结构改造工程正是基于改变自身一级结构来达到改变其物理学特性的方法。这里的一级结构，包括糖基的组成、糖基排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头碳构型以及糖链有无分支、分支度的大小等。

伴随着多糖合成遗传调控机制研究的增多，利用基因工程方法改造多糖结构的方法逐渐增多。例如，Hassler等[19]将控制黄原胶侧链合成的特定基因片段改造后，与野生型菌相比明显改变了其多糖黏稠特性。Breedveld等[20]利用随机突变使L sakei 0-1突变菌株其多糖组成单元发生变化。而多糖基因簇在异源表达方面也取得了显著的结果。Stingele等[21]将S thermophilus Sfi6控制多糖基因簇在L lactis MG1363中表达，尽管多糖分子质量大小相近，但组成多糖分子的糖基单元发生改变，产生了一种新型多糖，其主链骨架重复单元由N-乙酰半乳糖胺代替半乳糖，侧链缺乏半乳糖。Knoshaug等[22]发现L lactis subsp cremoris Ropy352突变株cremoris EK240中质粒上2个阅读框epsM和epsN编码新的糖基转移酶，导致新多聚物的产生，为乳球菌中多糖基因重组和进化提供了遗传学证据。Provencher等[23]利用同源简并混合寡核苷酸引物介导PCR检测产糖菌中类似起始糖基转移酶基因，为比较分析不同菌之间类似基因提供了方便。随着越来越多糖基转移酶功能的确定，更多的学者希望在产糖乳酸菌和其他细菌中引入新型的糖基转移酶，即结合多糖基因簇的异源表达，构建新型产糖基因簇，直接改变糖基转移酶的表达，从而产生特定新型寡糖和多聚糖。但要在多糖结构改造工程中取得更大突破，还有待对胞外多糖结构与合成多糖代谢相关的基因功能深入研究的基础上才能实现。

3.2 EPS产量控制

长久以来，乳酸菌胞外多糖作为一种食品安全级多糖而受到人们的关注，其多糖产量与甘蓝黑腐病黄单孢菌产黄原胶量相比，乳酸菌胞外多糖产量低且不稳定，下游处理困难。进一步了解微生物EPS的处理工艺、生物合成以及出发菌株的微生物学、生物化学和遗传学等方面的特征，将有助于改良菌种，提高EPS产量。

在生产过程中人们发现，乳酸菌产糖特性在高温、多次传代和发酵过程中表现出不稳定性，这可能与遗传的不稳定性有关。例如控制多糖基因的重排与外来基因插入，或产糖相关质粒的丢失都会影响产糖特性。另有报道表明，乳酸菌最大产多糖培养条件与其自身最适生长条件并不相同。因此，根据乳酸菌的生物学特性，设计合适的培养条件、通过适当的筛选条件选出高产突变株或利用基因工程手段控制产糖相关基因的表达，都是提高EPS产量的途径。

3.2.1 传统方法 它主要是从菌种及生长条件出发进行优化，如菌种选育、培养基以及发酵条件的优化。传统的培养基与发酵条件的优化也有许多新进展，如Desai等[24]结合了PlaCkett-B-（PB）技术，人工神经网络（artificial neural networks，ANN）以及遗传学算法（genetic algorithms，GA）3种方法，设计最优培养基组分，筛选出出发菌株产EPS的最优方案。除此之外，还产生了许多改进的生产方式，例如在发酵方式上有连续和补料分批发酵、两步法发酵等[25-27]。Looijesteijn等[28]将乳球菌NIZO B40分别在葡萄糖与果糖条件下进行培养，发现在前者条件下糖产量明显高于后者。

3.2.2 基因工程 当前，优化菌株更高效的方法是基因工程，即利用DNA技术定向导入改造基因，进而改变微生物物理特性，更具有针对性。Gilbert等[29]将S pneumoniae中的cps3S和cps3D在L lactis中过表达，引起低量的CPS产生；但将编码gal同系物的cps3U基因与之共表达，可大量增加CPS的产量。Boels等[30]将E coli中的pgm基因在L lactis中过表达导致UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖大量提高。另外，对乳酸乳球菌NIZO B40 eps基因簇的高效表达使胞外多糖的产量提高了4倍。Ramos等研究了乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的EPS产生菌和非产生菌的EPS产生与葡萄糖代谢关系，发现6-磷酸葡萄糖是糖酵解和EPS生物合成分歧点的关键代谢物，该研究为寻找通过遗传操作提高EPS产量的方法提供了线索。最近，Bouazzaoui等[31]利用反义RNA调控糖基转移酶的表达，而影响一株鼠李糖乳杆菌分泌胞外多糖的分子质量大小，产生短链的多糖，显著改变了其拉丝的长度。此方法在通常的基因失活方法不可行时，是很好的供选方法。

3.2.3 代谢工程 其就是利用重组DNA技术通过改变细胞内有关的酶活、酶量和输送体系、调节功能，改变细胞的遗传特性以改进微生物某些代谢活性，最大限度地提高目的产物产率。例如，利用将胞外多糖前体合成途径（图1）中持家基因编码的关键酶：磷酸葡萄糖变位酶（pgm）、焦磷酸化酶（galU）和差向异构酶（galE）进行调控，有助于提高胞外多糖前体的合成量，进而提高其产量。Fredrik等[32]分离并克隆了galU，该基因编码UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。从图1可以看出，该酶催化胞外多糖合成前体UDP-葡萄糖的合成。增加galU的表达量可使酶的活力提高10倍，但胞外多糖的产量却未有增加。以乳糖作为碳源，同时增大galU和pgm的表达量时，嗜热链球菌胞外多糖的产量提高了近1倍。Welman等[33]证实在德氏乳杆菌保加利亚亚种NCFB2483中通过调节前体合成酶UGPase和UDP－半乳糖差向异构酶的活性，可以明显提高EPS的产量。

由代谢调控可知多糖产量不仅受糖基核苷酸数量影响，更多的是与糖合成机制有关。因此，尝试建立碳水化合物代谢模型[34]，进行代谢控制分析（Metabolic control analysis，MCA），监测特定碳的输出，从而揭示关键控制点，据此设计代谢工艺流程，对提高多糖产量研究将很有帮助。

4 结语和展望

有专家提出，要生产出风味和稳定性良好的高质量酸乳，分解代谢不是成功发酵的唯一重要因素，合成代谢途径在形成有利于改善酸乳的质构和有利于人体健康的多糖及其他化合物中，也起到重要作用。

根据糖基代谢途径和胞外多糖合成过程的分析，通过基因工程方法提高代谢途径中酶的表达量，进而提高胞外多糖的产量，已引起众多研究者的关注。笔者认为，随着产多糖相关基因功能、多糖结构与功能关系进一步的确定，并且结合糖代谢控制和生物信息学分析，弄清其遗传背景，可为通过基因工程获得高产优质胞外多糖菌株奠定基础。但要在生产实践中构建和应用这类菌株，还需逐步建立和改进食品级表达系统。此外，转基因菌株对人体的安全性问题也应予充分考虑，这样才能最终获得安全且高效的基因改良菌株。

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