粪便中小肠结肠炎耶尔森菌PCR检测方法的建立

段丽莉

（吉林省吉林市疾病预防控制中心微生物科，吉林吉林 132001）

粪便中小肠结肠炎耶尔森菌PCR检测方法的建立

段丽莉

（吉林省吉林市疾病预防控制中心微生物科，吉林吉林 132001）

小肠结肠炎耶尔森菌是一种人畜共患的病原菌。它在自然界中广泛分布，包括人、猪、牛等哺乳动物，禽类的排泄物，蜗牛等冷血动物，昆虫，未处理的冷水，污水，肉，乳制品，蛋制品，水产品和冰激凌。所致疾病主要有胃肠炎型和肠道外型。我科应用PCR方法检测小肠结肠炎耶尔森菌，及时发现患者和带菌者，为流行病学提供实验室依据，及时控制传染源，为预防疾病起重要作用。

小肠结肠炎耶尔森菌；PCR检测方法；病原菌

小肠结肠炎耶尔森菌所致疾病在世界上广泛分布，但多集中在寒冷地区，在我国东北地区小肠结肠炎耶尔森菌各血清型的分布亦较广泛。本菌可感染人类以及多种动物，包括家畜、兽类、禽类、鸟类和昆虫，并通过排泄物和污染的水、食品传播。

1 实验方法

1.1 试剂

干燥培养基（北京陆桥生物技术有限公司）；生物梅里埃API20E生化条；诊断血清。

1.2 仪器

美国BIO-PCR仪；Thermo生物安全柜；离心机。

1.3 样品采集

采集急性期、用药前采集患者新鲜粪便标本8例，每份2～5 g，放入Cary-Blair半固体保存培养基中，4℃冷藏运送至实验室。

1.4 操作

1.4.1 增菌

取1 g粪便接种于10 ml改良PBS培养基上，置于4℃冷增菌10～20 d。在冷增菌的第7、14、21天划线接种于耶尔森选择性平板、麦康凯平板，25℃培养24 h。增菌管内液体量较大，在接种前应轻轻混匀，再用接种环挑取液体，接种于预先准备好的上述平板，采取分区划线的方式，一般划3～4区，目的是划出单个菌落。由于总体菌量一般不大，每区划完后可不必烧灼接种环，直接划下一区即可。

1.4.2 培养

直接取粪便标本接种选择性平板（耶尔森选择性平板、麦康凯平板），25℃培养 24 h。

1.4.3 鉴定

1.4.3.1 形态学鉴定 在耶尔森选择性培养基上25℃培养24 h，形成较小的湿润菌落，直径为1～2 mm。中心呈深玫瑰红色，凸起较尖锐，周围有明显的透明环，称“公牛眼”。麦康凯平板25℃培养24 h，形成直径为0.5～1.0 mm的小菌落，菌落为圆形、光滑、湿润、扁平略有凸起、半透明，中央有极淡的粉色[1]。

1.4.3.2 生化鉴定 从选择性培养基上挑取5个可疑菌落进行生化鉴定。

改良克氏双糖试验：挑取可疑菌落接种于改良克氏双糖斜面（用甘露醇取代乳糖），25℃培养 24～48 h[2]。挑选斜边、底层均变为黄色（A/A）、不产H2S、不产气的菌株进一步鉴定。

尿素酶试验和动力观察：将改良克氏双糖上的可疑培养物接种到尿素培养基上，注意接种量要大，挑取一接种环，振摇数分钟，25℃培养2～4 h。然后将阳性者接种2管半固体，分别置于25℃和37℃温箱培养24 h，在25℃有动力者，进行镜检和进一步生化试验。

系统生化鉴定：可挑取上述可疑的菌落直接用API20E生化条进行系统生化鉴定，确定菌株种属。见表1。

表1菌株种属生化鉴别

血清学鉴定：使用致病性菌株常见血清型（我国一般为O∶3、O∶8、O∶9 型）的特异性单克隆抗体进行玻片凝集，从而进行进一步鉴定和血清分型[3-4]。

PCR鉴定：毒力基因扩增，主要进行以下5个基因的PCR检测。

A.染色体源毒力基因

A1 ail：是黏附侵袭位点基因，介导小肠结肠炎耶尔森菌的侵袭性。

A2 ystA：是小肠结肠炎耶尔森菌耐热性肠毒素A基因，编码致病性小肠结肠炎耶尔森菌分泌的一种耐热肠毒素，是小肠结肠炎耶尔森菌致泻的主要原因。

A3 ystB（主要为生物1A型小肠结肠炎耶尔森菌携带的）：编码一种性质类似于ystA的耐热性肠毒素，ystB仅存在于生物1A型的菌株，而且在这个生物型中，目前证实这类菌株通常是非致病性菌株。研究报道此类菌株在腹泻患者中能够分离到。因此，这类菌株能否引起一些轻微的疾病有待进一步研究，它是否能够作为毒力决定因子，有待进一步研究。

B.质粒（pYV）源毒力基因

B1 yadA：黏附素，涉及自凝、血清抗性和黏附。

B2 virF：yop调节子的转录活化因子，yops调节蛋白，是致病所必须的。

C.其他有关基因的扩增

rfbC：该基因定位于rfb基因簇，O∶3血清型菌株特异性脂多糖O-侧链的生物合成。

D.PCR扩增程序

D1 DNA模板制备：一般检测使用水煮模板即可（如果进行分子生物学研究，可以使用试剂盒提取全基因组DNA，但成本较高），挑取平板上适量菌苔（200 μl枪头尖大小），悬浊于 100 μl超纯水，-80℃或液氮速冻 30 min（-20℃冰冻延长时间也可）后迅速沸水浴 20～30 min，12 000 r/min 离心 5 min，取上清液用作模板。

D2引物序列及扩增条件见表2。

表2 毒力基因PCR扩增引物序列

D3扩增体系：采用20.0 μl PCR扩增体系，主要试剂浓度为：dNTP40mmol/μl，MgCl22.5mmol/L，引物各 1.0 μl （0.5 OD引物干粉+134 μl水），浓度为 20 μmol/L 左右；Taq 酶 5 U/μl。 见表3。

10×buffer分别含有Mg2+与不含Mg2+两种。含有Mg2+的10×buffer使用更方便，并且含有Mg2+的10×buffer在混匀体系及分装时不易起泡，能够避免因泡沫造成的浪费及体积不准确。含有Mg2+的10×buffer的加入量同表3，MgCl2体积用水补齐。

D4扩增及电泳：扩增参数为94℃预变性5 min，94℃变性 15 s，退火 30 s（退火温度见表 2），72℃延伸 30 s，25 个循环，最后72℃延伸5 min，行1.5%琼脂糖凝胶电泳。

表3 PCR扩增体系

注意：同样由于耐热DNA酶，扩增产物应尽快电泳。如果需要过夜，则要加入适量EDTA，并且置于-20℃保存。

2 结果

O∶3血清型菌株rfbC扩增结果为阳性（rfbC+）。典型的致病性菌株的毒力基因的分布为 ail+、ystA+、yadA+、virF+、ystB-。传统意义上的致病性菌株不携带ystB，非致病性菌株不携带 ail、ystA、yadA、virF。

生化反应是小肠结肠炎耶尔森菌鉴定的主要依据，同时还可作为生物分型的依据。生物分型在临床上有重要意义。由于生物1A型（用水杨苷和七叶苷的阳性反应来确定该生物型）绝大多数是非致病性菌株，所以分离到小肠结肠炎耶尔森菌之后，应进一步做生物分型。另外，小肠结肠炎耶尔森菌的致病血清型分别与生物1B、2、3、4和5型有密切关联。常用的生物分型方法见表4。

3 讨论

小肠结肠炎耶尔森菌能产生一种耐热DNA酶，水煮不能使其失活。因此，水煮模板应尽快使用（一般不要超过1周；如果是扩增ystA等小片段，最好使用新鲜制备的模板，可信度较高），-20℃保存，并且避免反复冻融。

小肠结肠炎耶尔森菌在普通平板或斜面上可以存活2周以上。在0.4%脑心浸液半固体培养基上至少可以保存1年以上，可以作为短期保存或运输。长期保存菌株使用15%～20%甘油肉汤（本实验室采用20%甘油-脑心浸液培养基）冻存。将大量菌苔充分悬浊于冻存液中，-80℃冻存，可保存数十年。接种菌量大有利于菌种的保存。长期保存菌种的最佳方法是进行冻干，将菌液悬浊于5%脱脂牛奶中，冻干后抽真空封口，室温即可长期保存。

按照《人间传染的病原微生物名录》，小肠结肠炎耶尔森菌属于第三类病原微生物，实验活动应在生物安全二级实验室内进行，并采取相应的个人防护。小肠结肠炎耶尔森菌对外环境的抵抗力强，但对常用消毒剂及各种物理消毒方法均敏感，污染的台面、地面可用1 000～2 000 mg/L有效氯的含氯消毒剂擦拭，检测过程中使用的标本、用具和其他所有潜在的污染物应当作为具有传染性的物质进行消毒处理，121℃，30 min高压灭菌。操作人员需经过培训，并通过生物安全考核和实验室考核方可上岗。

[1]中华人民共和国卫生部.感染性腹泻诊断标准(WS271-2007)[S].2007:15.

[2]中华人民共和国卫生部、中国国家标准化管理委员会.GB/T4789.8-2008食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验[M].北京:标准出版社,2009:3.

[3]齐小秋.病原生物学检验[M].北京:人民卫生出版社,2003:327.

[4]何晓青.卫生防疫细菌检验[M].北京:新华出版社,1989:330.

R37

A

1673-7210（2010）02（b）-023－03

2009-10-28）