全自动免疫组化仪的应用及影响其染色质量的因素探讨

虞 杰，石伟强

（1.苏州大学附属第一医院病理科；2.苏州大学医学部，江苏苏州 215123）

全自动免疫组化仪的应用及影响其染色质量的因素探讨

虞 杰1,2，石伟强1

（1.苏州大学附属第一医院病理科；2.苏州大学医学部，江苏苏州 215123）

目前，在免疫组织化学染色中，全自动免疫组化仪越来越多地得到应用。与传统手工操作方法相比，它具有精确、科学、灵活、方便、高效、环保的特点，优势明显。同时，新设备的使用也带来了很多新的问题，对染色结果存在很多新的影响因素。对全自动免疫组化仪的这些优势和不足进行探讨，有利于更好地保证染色质量，从而进一步保证诊断的准确性。

全自动免疫组化仪；染色质量；应用；影响因素

免疫组织化学染色一直是病理诊断的重要辅助手段，近年来，随着免疫组织化学新抗体的不断出现，免疫组织化学也正逐渐走出单一的辅助常规病理诊断的角色，发展为科学研究、判断病人愈后以及协助临床用药的重要辅助手段。新的定位与责任对免疫组化结果的准确性、稳定性要求也随之提高，因此，制片质量的高低显得更为重要。近年来，各种型号自动免疫组化仪投入应用，这一更精确、更科学、更灵活、更方便、更高效、更环保的免疫组化染色方式正在被越来越多的医疗机构、科研院所所接受。新设备的运用使得以往手工操作方式下免疫组织化学染色的很多影响因素得到解决。但是，它的使用同时也带来了一些新的问题，有待得到有效解决。本科室自2010年起使用美国罗氏公司BenchMark XT全自动免疫组化仪，对其优势及影响其染色结果的具体因素进行了一些归纳和总结。

1 材料与方法

1.1材料仪器与试剂 选取我院2010年1月到2011年6月淋巴瘤组织标本30例及乳腺癌组织标本各20例，美国罗氏公司BenchMark XT全自动多功能组织病理检测系统主机（包含检测试剂模块、染色模块、散装液体模块及废液收集模块），此外还有与之配套的惠普计算机及专业操作软件（VENTANA Medical System-BenchMark XT IHC/ISH Stainingmodule）、激光条码标签打印机(VENTANA)。试剂选用DAKO公司的浓缩型一抗以及仪器系统配套的250次检测试剂盒（主要包括二抗、DAB显色系统、苏木素返蓝复染系统等）、脱蜡液、液体封盖膜、氯化钠柠檬酸钠、reaction buffer、CC1细胞预处理液、CC2细胞预处理液等。

1.2 方法 选用15种淋巴瘤及乳腺癌常用抗体分别进行手工及全自动免疫组化仪染色，10%中性福尔马林固定，一般以4-6h为宜，最长不超过24h，常规包埋组织石蜡块，常规切片（4-6um）并将切片捞于预先经过2%APES丙酮处理过的防脱玻片上，60℃烘箱烘干1-2h以上。

手工染色方法采用Elivison两步法进行染色。

自动染色方法使用专业电脑操作程序（VENTANA Medical System-BenchMark XT IHC/ISH Stainingmodule）将日常使用的指标一一进行染色流程的编辑设置（主要是各种染色试剂信息：是否由机器脱蜡、复染；是否自动滴加一抗、脱蜡、抗原修复；设定一抗、二抗、复染的时间和温度等）并保存。

配制各种常用一抗，充填于与主器配套的专门试剂瓶，编辑扫描试剂瓶上的激光条码，使之与之前所保存的相应指标的染色流程相联。

扫描系统配套的250次检测试剂盒（主要包括二抗、DAB显色系统、苏木素返蓝复染系统等），并将其安装于可拆分试剂架上。

将仪器厂家配套的主机散装液体模块中的各种试剂（包括脱蜡液、液体封盖膜、氯化钠柠檬酸钠、reaction buffer、CC1细胞预处理液、CC2细胞预处理液等）按说明书要求比例进行调配，并充填于主机相对位置的试剂瓶中。所有的试剂使用前都要通过激光条码扫描系统预先确认。

编辑打印防水条码切片标签（包括免疫指标、病理号、免疫号、送检医院等病人信息），粘贴于切片一侧。将切片分别置于染色模块中的独立温控切片位上。再将装有一抗及仪器配套检测试剂盒的试剂架安装于主机旋转式试剂台上。点击电脑操作软件中的“RUN”键设定本次染色切片数（1-30张），并根据需要选择是否设定延迟染色开始或结束时间，点击确定开始程序，此后所有染色工作均由机器自动完成。

自动染色程序完成后，取出切片插入切片架，用洗洁精清洗切片上的残余油膜和试剂，清水冲洗，之后梯度酒精脱水，中性树胶封片。

2 结果及优势

2.1 本系统对每种抗体都专门设定了独立详细的染色流程，抗体滴加完全由系统通过激光扫描条码确认执行，每一张切片每一步的反应条件都可以得到精确控制。与手工染色结果比较分别见表1和图1-图4。

由表1和图1-4可见，全自动免疫组化仪染色有效避免了人工操作条件下的错误，染色结果的均一性和可重复性得到了保证，染色结果强度较高，着色均匀，定位准确，背景清晰，无边缘效应，整体上比较令人满意。

2.2 通过对染色开始时间及结束时间的合理设置，可以较为有效地解决该系统每批次处理切片数量较少的不足，从而提高工作效率。

2.3 全自动的染色过程，大幅度节约了人力，使实验操作人员得以科学安排工作，提高了工作效率。

2.4 由于使用的试剂中不含有二甲苯以及系统对废液中毒性较强的DAB的合理处理，大大减少了有毒物质对实验操作者身体的危害，增加了环保性和安全性，提升了实验室工作环境质量[1]。

3 染色结果的影响因素

3.1 组织的前期处理 固定时间要严格控制，一般以4-6h为宜，最长不超过24h，过长过短都会对染色结果产生不良影响。研究表明，组织固定时间不足易造成组织结构不清和抗原弥散，固定时间过长则会破坏或封闭组织的抗原活性，影响染色结果[2]。

3.2 切片的质量 良好的切片质量是保证染色质量的基本要求，切片要尽量做到平整，厚度适宜(4-6um)，尽量避免刀痕皱褶，有研究表明，刀痕和皱褶部位易引起假阳性[3]。应在切片前对组织蜡块进行-20°C左右低温冰冻3-5min，拧紧切片机各部位固定螺栓，切片时尽量避开刀锋缺口部位及使用新刀片，可有效避免刀痕和皱褶。

3.3 涂胶片的制备 脱片会直接影响染色结果。因此前期对玻片的处理是做好免疫组化的重要前提之一，最好使用涂胶玻片，防脱片效果较好。目前免疫组织化学染色中两种防脱片剂多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）和APES较为常用。多聚赖氨酸防脱片原理主要是通过多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用产生较强的黏合力。而APES则通过化学修饰玻璃表面，改变其物理化学特性从而达到防脱片效果。经过实践研究表明，经过APES处理的玻片防脱片效果较好[4]。应使用2%APES丙酮预先浸泡玻片1-2min，丙酮浸泡1-2min，再用蒸馏水浸洗1-2min，烤干备用，这样可以有效防止脱片。

3.4 试剂 抗体的质量是染色成功与否的重要保证，要选择品牌好、质量过关的试剂，多次实验表明，基因、迈新、中山等公司的产品使用效果都较为理想。

各种试剂均应严格按照厂商要求的浓度比例进行配制，且使用前必须彻底混匀，否则易造成假阴性甚至完全不着色的结果。

多数试剂的最佳保存温度为4℃左右。温度过高会引起试剂效价降低。手工方法进行免疫组化染色时，各种抗体试剂只需依次在使用时临时从4℃冰箱取出滴加，滴加完毕后立即放回冰箱，在外部环境中放置时间较短。使用全自动免疫组化仪染色时，由于旋转式试剂台是开放式的，不具备温度调节功能，整个染色过程的3-4h中，所有试剂都长时间暴露在外部环境中，因此对实验室的温度有较高要求。正常情况下实验室温度应最好控制在25℃以下，且对于暂时不用的试剂也应及时放入4℃冰箱保存。

3.5 试剂瓶安装及检查 虽然本机通过激光条码扫描识别试剂瓶，对试剂瓶的安装顺序没有严格的要求，但有时机器自检时并不一定能够发现试剂瓶安装位置上的一些细小偏差，会导致程序运行时试剂不能顺利通过试剂盘底部的滴加孔滴加到标本上，造成假阴性，因此，在正式运行程序前，必须仔细检查各个试剂是否安装到位、准确无误，确认试剂瓶滴加口是否对准底盘滴加孔。

有些特殊情况下试剂瓶发生泄露，会导致瓶中试剂余量低于系统默认余量；试剂瓶滴加口空气未能排空，可导致染色程序运行过程中部分试剂无法成功滴到部分或全部切片上，造成染色失败。因此正式运行程序前必须检查各试剂瓶中液面高度以及滴加口是否有空气未被排空。

3.6 其他因素 除以上诸种因素外，还有其他一些因素也应引起注意，如应为系统配置专用不间断电源，以防止系统运行期间突然断电造成的损害；由专人定期做好机器的清洗及日常维护保养工作，使之保持最佳状态；尽量不要在机器配套的电脑上插外来盘或安装无关软件，防止计算机病毒侵害或加重系统负担。

其他一些品牌型号的自动免疫组化仪如美国BioGenex i6000全自动免疫组化染色仪，不具备组织切片脱蜡、抗原修复以及染色后的苏木素复染、分化、返蓝功能，也不具备激光条码标签扫描功能，每次染色前都需要操作人员通过系统对组织切片及试剂安装位置进行一一设置。同时，由于无法调节反应温度以及无法预先针对各种不同抗体设置独立染色程序，因此对染色条件也达不到精确控制，切片染色很难达到最佳效果。而没有经过环保处理过的废液也会对环境及操作人员的身体造成危害。相比之下，BenchMark XT全自动免疫组化仪很好地解决了上述问题。当然，即使是再先进的全自动免疫组化仪也不是完美无缺的，实验技术人员丰富的工作经验以及认真负责的态度同样是切片染色质量的重要保证。

[1]罗小平,胡维维,伍尚金.全自动免疫组化染色仪与人工操作的比较[J].医疗卫生装备,2007,28(4):59-60.

[2]梁英杰.免疫组织化学技术制片的规范和质量控制[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2004,13(2):262-264.

[3]陈萍倩,张蓉,陆敏华,等.自动免疫组化染色仪在免疫组化染色中的应用[J].JDiag Pathol,2003,10(4):238.

[4]虞杰,顾冬梅,郭凌川.肪脱片剂在免疫组织化学染色中的应用[J].中国血液流变学杂志,2008,18(3):432-433.

[5]杨月红,袁静萍,袁修学,等.自动免疫组化仪的使用体会[J].临床与实验病理杂志,2011,27(3):333-334.

[6]姜冰,杨军,彭长缨,等.全自动免疫组化染色仪在临床病理的应用[J].中国现代医学杂志,2008,18(18):2745-2746.

[7]孙琪,李燕,李晶.免疫组化染色质量控制的经验和体会[J].宁夏医科大学学报,2010,32(1):146-147.

Investigation for Application and Factorsof Influencing Staining Qualitiesof Immunohistochem istry Autostainer

YU Jie,SHIWei-qiang
(Department of Pathology,ThefirstAffiliatedHospital of SuzhouUniversity,SuzhouJiangsu215006,China)

In current,immunohisto chemistry auto stainerha sbeen applicated in immunohi stoche mistry staining moreand more.Comparew ith traditiona lmanual operation.It has some good ness like accurat escientific flexible convenient efficient environmental.

immunohis to chemistry autostainer;staining qualities；application;influencing factor

R446

A

1671-0142（2011）06-0069-03

虞杰（1979-）,男,江苏苏州人,主管技师,在读硕士研究生,研究方向为病理与病理生理学.

（责任编辑 刘 红）