16α，17α-环氧黄体酮C11β-羟基化微生物的选育

吴定伟 王丽娅 陈小龙 万建峰

（1浙江仙琚制药股份有限公司，浙江 仙居 317300；2浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江 杭州 310014；3浙江经贸职业技术学院应用工程系，浙江 杭州 310018）

甾体类化合物都具有环戊烷并多氢菲结构，常见的如甾体激素黄体酮、睾酮，以及内源性物质胆固醇［1］。人们对甾体化合物的研究已经开展数十年，发现其对糖代谢、脂肪代谢、蛋白质合成、矿物质合成以及性功能和神经调节等都具有重要的生理功能，目前已经有几十种上市的甾体药物，其治疗领域包括抗炎、抗过敏、降压、避孕、增强抵抗力和抗肿瘤等［2-3］。

在上市的甾体药物中，糖皮质激素类药物临床应用最为广泛，是最为重要的甾体类药物。它们具有强大的抗炎活性，适用于各种炎症，过敏性疾病和休克等危重疾病，其结构中11-β羟基是化合物产生抗炎活性的关键药效片段。由于甾体结构的特点，采用化学方法进行11-β羟基化反应费时、费力，且很难保证11位羟基的β构型。而采用微生物转化法却能选择性的在甾体的11位引入羟基，迄今为止，已经相继发现具有甾体羟化作用的细菌、放线菌、真菌、霉菌等。其中国内大多数甾体生产企业采用蓝色犁头霉进行11-羟化反应，但是仍存在选择性较差，易产生11-α羟化产物以及其他位置羟化产物，收率在45％左右［4-6］。另外也有文献报道采用新月弯孢霉、黑根霉等菌种进行微生物转化，收率也仅有一定幅度的提高，达到50％左右。因此，有必要进一步对多个菌种进行筛选和培育，力求获得高效11β-羟基化沃氏氧化物的微生物菌株。本论文采用紫外诱变、低能氮离子注入诱变和钴-60诱变这3种国内外常用方法对菌种施行多样化的选育操作［7-10］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

雅致小克银汉霉Cunningnamella elegans（编号40250），购自北京微生物菌种保藏中心，其他菌种均来自浙江仙琚制药股份有限公司。

1.1.2 基础培养基

葡萄糖3％，玉米浆3.5％，（NH4）2SO40.5％，酵母粉0.25％，玉米油0.1％。

1.1.3 主要设备和试剂

高效液相色谱仪，日本岛津公司生产的LC-10A。钴-60诱变在浙江省农科院进行。低能氮离子注入诱变在浙江工业大学进行。沃氏氧化物、11β-羟基-16α，17α-环氧孕酮和11α-羟基-16α，17α-环氧孕酮霉菌氧化物由浙江仙琚制药股份有限公司提供。高效液相色谱用甲醇和乙腈为色谱级，其他试剂均为分析纯。

1.2 分析方法

1.2.1 菌悬液的pH测定及菌体重量测定

将矫正好的pH电极放入被测菌悬液中，等读数稳定后读取显示器上的数字即为该菌液的pH值。将摇床培养48h后的菌悬液抽滤，称量菌体重量，记为W湿，然后将其放入烘箱里烘至恒重，取出称量记为W干。

1.2.2 转化底物和产物检测

采用HPLC法分析转化底物和产物。色谱条件：C18反相色谱柱，流动相：乙腈：水=60：40，检测波长：245nm，流速：1.5mL/min，进样量：10μL。

1.3 实验方法

1.3.1 土豆培养基和基础培养基的配制

斜面培养基：PDA培养基。基础培养基：葡萄糖3％、玉米浆3％、（NH4）2SO40.5％、酵母粉0.25％，FeSO40.01％和玉米油0.1％，培养基经121℃灭菌20min，备用。

1.3.2 菌种活化

菌种转接到PDA斜面，在28℃下培养3d。

1.3.3 底物投料

称取6g沃氏氧化物，3.6g β-环糊精及少量吐温80，溶于60mL的水中，在加热条件下充分搅拌。用移液管吸取5mL的底物溶液加入已经培养22h的摇瓶中，继续培养48h进行羟化反应。

1.3.4 发酵液的预处理将发酵转化后得到的发酵液混合物先测其pH值，然后过滤去除上清液，取0.1g湿菌丝体，其余称量湿重W湿，然后放入烘箱里80℃下干燥并称其重W干。在0.1g湿菌丝体中用5mL的乙酸乙酯在密封条件下萃取30min。离心后取萃取液1mL于EP管中，用吹风机吹干，再加入1mL的分析纯甲醇，震荡溶解5min，冰箱保存待检测。

1.3.5 诱变方法

1.3.5.1 紫外诱变

将200μL菌悬液（或加入底物）接入培养皿，启动磁力搅拌器，使用20W功率紫外灯管，照射距离为15cm。实验诱变时间分别设定为30s和60s，处理过程在暗室操作。处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用密封纸盒包起来培养，最后放入25℃恒温培养箱内培养2～3d，期间观察菌体长势，然后再进行分离筛选。

1.3.5.2 低能氮离子注入诱变

吸取200μL的孢子液涂到无菌玻璃平皿上，同时用一个平皿进行真空处理对照，另一个平皿做外环境对照。用涂棒涂匀，放在无菌操作台上吹干后，再置于离子束装置靶室，分别用20keV的氮离子（N+）照射处理，剂量为90s、120s、150s（离子束单位为×2.6×1013ions/cm2·s），选取大剂量240s和300s做参照。

1.3.5.3 钴-60诱变

选定5个照射的剂量：1000，1200，1400，1600和1800keV进行Co-60诱变，将诱变的菌悬液稀释成5个梯度，稀释后的菌悬液注入25个培养皿中，使用土豆培养基，最后放入恒温箱内培养。

2 结果与讨论

2.1不同微生物菌株转化能力的比较

表1 不同微生物菌株转化能力的比较

从表1中可以发现S 418黑根霉发酵产物中不含有11β-沃氏物，而11α-沃氏物的含量很高，结果与文献数据相符，验证了S 418黑根霉能提高产物11α位点的转化率，11β位点基本不发生反应。新月弯孢霉X1和X2的发酵产物中都不含有11β-沃氏物，这与国外的研究成果不相符，通过观察活化的菌种发现其形态和颜色与文献中的描述不相同（重复活化情况仍相同），怀疑菌种可能已经退化或者染菌，后期实验放弃使用。蓝色犁头霉D1、D2、D5的底物转化率偏低，同时产物中不含有11β-沃氏物，蓝色犁头霉和银汉霉的发酵产物与其他5种菌相比含11β-沃氏物但含量偏低。

2.2 紫外诱变育种

表2 紫外诱变蓝色犁头霉

表2显示转化率没有明显的提高，致死率基本都达到了90％以上，可能是照射时间不够，只有2个菌株的产率高于初始数据，正变率为16.7％，产量提升仅为15％。

表3 紫外诱变银汉霉

而表3中显示转化率有一定波动幅度，一些产率提高了20％，在大剂量240s均发现产率出现了下降，采用相同方式再进行一次操作得出类似的结果。表明在大剂量诱变的情况下，正突变频率并没有增加，正变率仅为8.7％，同时产率浮动较大。通过多次的诱变发现，银汉霉的诱变菌株相比蓝色犁头霉诱变株产率提升较大，但是11β-沃氏物含量仍然停留在5％左右，与文献中40％～45％的转化率有很大差距。如果进一步增加照射时间有又会对菌种造成损害，同时也无法保证产率能获得质的提升。

2.3 低能氮离子注入诱变育种

从表4可看出，在20keV的能量、90s～150s的剂量范围内，银汉霉的致死率并没有一直随着照射剂量的增加而上升，而是随着氮离子（N+）照射剂量的加大先增大后降低，同期实验获得的结果相同，这是因为用离子束照射处理微生物可能产生先降后升再降的"马鞍型"存活曲线。从表中可以看出，菌种诱变结果大部分为正常范围或正变，产率提高了20％～40％，正变率达15.6％。通过加大剂量又会导致菌体无法生长，选择在低剂量的范围比较合适，在20keV的能量下，剂量90s和120s时的正变率最高，最高含量达到5.8％。

表4 低能氮离子注入诱变银汉霉

2.4 钴-60诱变育种

表5 钴-60诱变银汉霉

从表5中看出，菌种诱变结果大部分为正常范围或负变，正变率依旧为0。随着照射剂量的增加产率并没有明显的变化，同时获得的单菌落数量偏少。考虑Co-60诱变是一种破坏性较强的诱变过程，在照射时对银汉霉菌体造成了不可恢复的影响。

4 结论

以保藏菌株土曲霉蓝色梨头霉（Absidia coerulea）40302和雅致小克银汉霉（Cunni ngnamella elegans）40250为出发菌株，经等离子注入、紫外线、Co-60等方法对菌种进行筛选。通过比对4种实验方法发现，化学诱变方法与Co-60诱变导致菌体发生负突变的几率较大，经紫外诱变处理后的结果基本处于正常范围，等离子注入诱变的正突变率最高。经等离子注入诱变处理筛选后，条件为照射剂量20keV，照射时间90s，获得一株性能稳定的银汉霉突变株，28℃摇瓶发酵22h，48h后投料，C11β-羟基-16α，17α-环氧孕酮的转化率达到5.8％，相比最初的转化率提高了30％。说明采用等离子注入诱变方法是有效的。

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