健康成人棕色脂肪组织的功能

基尔西

健康成人棕色脂肪组织的功能

基尔西

在冷环境刺激下，我们利用正电子发射计算机断层扫描（PET）检测出健康受试者（5名）被激活的棕色脂肪组织，位于下颈部和锁骨上部之间，还发现此处的葡萄糖摄取量增加。我们获得其中三名受试者的组织活检标本，并对信使核糖核酸（mRNA）和棕色脂肪细胞的蛋白质标记物解偶联蛋白1（UCP1）进行了基因表达水平的检测；还对预留的样品进行了形态学评估以及生化分析，结果符合棕色脂肪的胞内特征（分布着很多小脂滴、呈现多室的脂滴）。以上结果表明，在健康成人体内，仍存在大量的有代谢活性的棕色脂肪组织。

以前人们认为，棕色脂肪组织在新生儿时帮助维持人体正常体温，之后这个组织随着年龄的增长不断退化，成年时则完全消失。现在认为，棕色脂肪组织仍存在于成人体内。已证明，在肿瘤自主性儿茶酚胺分泌（如，嗜铬细胞瘤和副神经节瘤）的患者，棕色脂肪组织可以清楚地显现出来。所以在诊断肿瘤和肿瘤转移时，使用葡萄糖代谢示踪剂F-FDG联合PET和CT扫描，其结果很可能被这个因素（棕色脂肪组织被清楚地显现出来）所干扰。锁骨上组织的葡萄糖摄取量较高，是因为存在在该部位的棕色脂肪组织增加了葡萄糖摄取量。这个观点已获得证据支持。研究表明，通过CT图像（由F-FDG作为示踪剂）可以清楚显现，脂肪组织对心得安(一种β受体阻滞剂, 用于治疗心律不齐、心绞痛等)和环境温度（PET扫描前）不同的敏感性；寒冷的冬季往往激活棕色脂肪组织产热，而不是炎热的夏季。但是就目前现有的知识，包括最近的研究调查结果，还没有直接的数据证明，在健康成人受试者，冷环境诱导的F-FDG摄取增加的组织，具有棕色脂肪组织的病理生理特点，其mRNA和相关蛋白（以区分白色脂肪组织）的表达也明确上调。这一点很重要，这证明了健康的成人同样存在棕色脂肪组织，这种组织在人类婴儿期后仍可以发挥其正常的生理功能。这些数据很必要获得证实。

方法

受试者

我们的研究共纳入了5名健康受试者，并都签署了书面知情同意书。研究方案由芬兰医院西南区的伦理委员会批准并进行了审查。受试者是通过在当地报纸刊登广告的方法招募的。对自愿参加的所有人都进行了代谢状况的检查。受试者的纳入条件是：糖耐量和心血管代谢状态正常（通过心电图和血压进行评估），年龄范围为20～50岁。

研究设计

研究分为冷暴露PET-CT研究和热暴露PET-CT研究。共5名受试者，两次PET-CT扫描都使用的是示踪剂F-FDG。

冷暴露PET-CT研究设计：①受试者穿着单薄，室内温度17℃～19℃，呆2小时；②冰水5℃～9℃，受试者的一只脚浸泡其中，冰水内外交替，各5分钟；③进行PET-CT扫描。

热暴露PET-CT研究设计：择日进行，其流程和冷暴露PET-CT研究基本一样，但不同的是，在扫描前没有冰水刺激。

这两部分最后的PET-CT扫描都是在受试者禁食过夜之后进行的（仰卧）。下一步进行组织活检。活检部位根据影像图上显现的被激活的褐色脂肪组织所在的部位来确定。组织活检共包括5名受试者中的3名（签署了脂肪组织活检知情同意书），都在局麻条件下进行组织切片（包括棕色和白色脂肪组织），进行组织留样，制成标本（见NEJM. org）。

PET扫描

按照图尔库PET中心的标准操作程序（以Hamacher等人先前使用的方法为基础，经过修订后的操作程序版本），采用F-FDG标记的正电子示踪剂进行联合显像。

PET试验开始时，通过导管经一侧臂静脉注入F-FDG；扫描期间获得对侧臂静脉血液样品。

活组织切片程序

受试者活组织切片是在局麻（利多卡因联合肾上腺素）情况下进行的。

棕色脂肪组织切片：根据3名受试者（开放标签）的PET-CT影像图显现的结果，整形外科医生对冷环境诱导的葡萄糖摄取量增加的部位，分别进行组织切片，获得受试者对应的组织样品（简称为，标本1，标本2，标本3）。组织切片随即被分为两个部分，一部分用福尔马林固定用于病理生理检测；另一部分存放于液态氮中冷冻以备用。接着对mRNA和cDNA进行实时定量的PCR分析。最后利用备用的样品对相关蛋白进行提取。

白色脂肪组织切片：和进行棕色脂肪组织切片同时进行，选择同一个手术的相同切口下的皮下脂肪，获得的组织切片采用同样的操作程序检测或留样，以作为对照。

共轭焦显微镜观察

我们进行了组织免疫化学的研究。把细胞培养在玻片上进行固定与染色，使用UCP1抗体，HRP（辣根过氧化物酶）标记抗体（经过化学方法将HRP标记在抗体IgG分子上而制成的HRP-抗体IgG结合物）；之后再以共轭焦显微镜观察。共轭焦显微镜所看到的影像利用的是其内建的扫描器，通过电脑运算将许多亮点组成线，很多线再组成单一平面影像的光切片，不同平面的切片组合在一起，就形成了三维空间的立体影像，再加入时间因子，就形成了动态的4D影像。

结果

受试者（5名）各自的影像图比较，结果显示一致，即，冷环境诱导（和热环境诱导相比）F-FDG摄取增加，最显著的部位是锁骨上区（图1A，1B和1C）。通过对影像图的统计分析（图1D），结果显示，锁骨上区的棕色脂肪组织比邻近部位的白色脂肪组织的葡萄糖摄取量显著增多，冷环境比热环境诱导的葡萄糖摄取量，在棕色脂肪组织平均增加约15个单位（P=0.005），在白色脂肪组织增加4个单位（P=0.01）（图1E）。

对应活组织切片标本No1、2、3的受试者No1、2、3的手术部位，分别是图1A、1B和1C中用箭头显示的部位。采用定量PCR技术对多基因的mRNA表达水平的分析结果见图2。对活组织切片标本的评估结果表明，作为棕色脂肪组织的标记基因UCP1，其在棕色脂肪组织的表达水平比其在白色脂肪组织的表达水平增加1000个单位还多。

UCP1具有解偶联作用。电子传递链产生H+跨线粒体内膜的势能。在偶联状态下，势能驱使H+通过ATP 合成酶而重新回到线粒体基质中，同时将势能转化为ATP 的化学能。由于UCP1在线粒体内膜上有特殊的通道，由电子传递链泵出的氢离子直接通过这种通道流回线粒体内，使跨线粒体内膜的质子电化学梯度消失，ADP不能进行磷酸化形成ATP，物质氧化与ATP 生成脱偶联，即质子渗漏，而成为产热过程，能量以热能形式释放，减少了ATP合成。这是一种自主性产热过程，目前认为这一过程对啮齿类动物（如，动物冬眠，人类新生儿）维持正常体温很重要。UCP1基因敲除小鼠的研究结果显示，在急性冷暴露条件下，表现维持正常体温的能力严重衰退，从而证明了UCP1对这一过程的有益作用。

图1-1 PET-CT扫描影像

图A、B、C分别显示的是受试者1、2、3的颈胸部影像。PET-CT使用的是示踪剂F-FDG。每一行左边显示的是经轴切片，中间是冠状切片，右边是矢状切片。箭头显示的是葡萄糖摄取增加的锁骨上部激活的棕色脂肪组织。影像图左边显示了F-FDG摄取水平的颜色比对，红色端表示最高水平。

图2显示了3名受试者棕色脂肪组织中的几个基因表达水平。棕色脂肪细胞DIO2的mRNA表达明显上调（和白色脂肪细胞相比）。这个结果很有意义，棕色脂肪细胞表达Dio2的目的，可能是为了使T3（三碘甲状腺氨酸）能够继续保持自身（棕色脂肪组织）高水平的新陈代谢。此外，图2还显示，棕色脂肪组织中的PGC1α的mRNA表达也明显上调。这并不令人惊讶，因为，冷环境诱导在很大程度上是首先通过激活PGC1α来使UCP1基因表达上调的。激活PGC1α是诱导产生UCP1的关键所在；在PGC1α敲除小鼠，cAMP诱导和冷诱导UCP1的活化水平显著降低。PRDM16是调节棕色脂肪细胞形成的关键转录因子（图2）。在成熟啮齿动物的棕色脂肪组织，ADRB3（β3-肾上腺素受体）是β-肾上腺素受体三个亚型中最重要的。我们发现，如图2所示，3名受试者的棕色脂肪组织中这种受体亚型表达也显著上调（和白色脂肪组织进行比较）。

图2显示的mRNA表达数据，是根据PETCT影像图确定的脂肪组织样本进行的检测结果，显示了棕色脂肪组织预期的基因表达谱。为了明确冷诱导F-FDG摄取增加的部位的组织样本表达UCP1，我们进行了Western blot（蛋白质印迹分析），结果显示，3名受试者所对应的棕色脂肪组织样本都检测到UCP1蛋白，而对应的白色脂肪组织对照样本中没有检测到任何UCP1，和预期的一样（图3A）。我们还检测了线粒体标记物细胞色素C，结果发现，棕色脂肪组织比白色脂肪组织有更多更充足的细胞色素C（图3B）。

对3名受试者的活检样品进行组织学分析，结果清楚地表明，锁骨上部棕色脂肪组织细胞内含有多室的脂滴，而邻近的白色脂肪组织细胞中却没有（图3C）。UCP1免疫荧光分析结果显示，棕色脂肪组织的UCP1水平很高，而白色脂肪组织几乎没有；这又一次说明基因表达和组织学特征间的关系（图3D）。

共轭焦显微镜观察结果显示，在棕色脂肪组织，UCP1蛋白信号和线粒体标记物COI（细胞色素氧化酶亚基I）的信号重叠，从覆盖面看，可以说两者共区域化（图3E）。在白色脂肪组织切片上没有检测到或观察到UCP1蛋白（图3E）。

图1-2 冷热暴露条件下脂肪组织消耗葡萄糖的量

图2 棕色和白色脂肪组织中的基因表达

图3-1 棕色和白色脂肪组织的免疫组织学分析

讨论

PET-CT研究和组织活体切片标本分析都表明，健康成人体内存在棕色脂肪组织。激活的棕色脂肪组织和白色脂肪组织相比，UCP1蛋白和细胞色素C的表达水平显著增强。人类棕色脂肪组织细胞内的线粒体非常致密，相比之下，白色脂肪组织细胞内的线粒体稀疏。

从本实验获得的数据和之前对棕色脂肪组织代谢研究的调查结果，我们推测，冷环境诱导激活棕色脂肪组织，可能对人类的能量平衡方面很重要。例如，从我们实验数据之一，PET-CT扫描得出的数据看，两侧锁骨上部棕色脂肪组织的重量为63g,葡萄糖的吸收率为12.2μmol/100g/min，那么可以得出整个组织的吸收率为7.7μmol/ min。如果激活的持续时间为24小时，那么由棕色脂肪摄取的葡萄糖一共为11 mmol。考虑到游离脂肪酸可促进质子经棕色脂肪组织细胞的解偶联蛋白返流至线粒体，这一发现可能是重要的。事实上，来源于所摄取的葡萄糖热量，只占整体（激活的棕色脂肪组织所产生）热量的10%左右。因此，如果该研究中的棕色脂肪组织得到充分激活的话，它所能消耗的能量相当于4.1kg脂肪组织一年所能消耗的能量总和。我们认为这是一个温和的假设，因为棕色脂肪组织的活化程度，很可能没有达到最大（我们估计是50%）。此外，啮齿动物模型的研究表明，完全激活棕色脂肪组织时所产生的总热量，来源于葡萄糖的“贡献”估计是2%。在此实验结果的基础上，我们推测，激活棕色脂肪组织有可能对人类的能量消耗有重要作用。

图3-2 棕色和白色脂肪组织的免疫荧光分析

总之，我们的研究表明，在冷环境背景下，锁骨上部棕色脂肪组织的葡萄糖摄取率比白色脂肪组织增加15个单位。还发现该组织表达多个基因（UCP1、DIO2、PGC1α、PRDM16和ADRB3）的mRNA；表达UCP1蛋白和细胞色素C的水平也显著上调（由免疫印迹分析评估）；此外，该组织细胞内含有多室的脂滴。最后，还显示了该组织所产生的UCP1蛋白的线粒体定位。我们认为，这些研究结果直接鉴定了人类棕色脂肪组织的功能。依据生化、分子和形态学标准，棕色脂肪组织仍存在于健康成人。因此，我们认为健康成人棕色脂肪组织值得进一步研究；鉴于目前肥胖流行，该组织将可能作为药物的靶向目标。

10.3969/j.issn.1672-7851.2011.02.010

瑞典生物医药研究所临床遗传学医学院

(庄稼英 编译)