肺积1号方影响小鼠肺癌移植瘤细胞周期蛋白D1表达的实验研究*

庄 静 王明霞 韩娜娜 刘丽娟 卜美玲

(1 潍坊市中医院肿瘤科，山东 潍坊 261041；2.潍坊医学院2009级研究生，山东 潍坊 261041；3.山东中医药大学2009级研究生，山东 济南 250000)

1 材料与方法

1.1材料 小鼠Lewis肺癌细胞株(Lewis lung carcinoma,LLC)，购自中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所；近交系C57BL/6小鼠，32只，雄性，6～8周龄，体质量(20±2)g，SPF级，由中国医学科学院实验动物研究所提供，许可证号：SCXK(京)-1100-0006；兔抗鼠CyclinD1单克隆抗体购自中杉金桥生物有限公司。

1.2方法

1.2.1造模、给药

取对数生长期的Lewis肺癌细胞，调整细胞浓度为1×107/ml。SPF级近交系C57BL/6小鼠32只，雄性，6～8周龄，体重(20±2)g，均于右侧腋窝皮下注射Lewis肺癌瘤源小鼠瘤细胞悬液0.2 ml，建立小鼠移植瘤模型。接种第5天，小鼠腋下均可触及粟粒大小移植瘤，造模成功率100%，按随机数字表法完全随机分为4组：模型组、肺积1号方小剂量、肺积1号方中剂量组、肺积1号方大剂量组，每组各8只。肺积1号方各组小鼠给药剂量：低剂量组20 g/kg，中剂量组40 g/kg ，高剂量组80 g/kg(分别相当于60 kg 成人临床用量的5 倍、10倍、20倍), 分别灌胃含生药1.0 g /m l、2.0 g /m l、4.0 g /m l的中药混悬液0.4 ml。

模型组：灌服生理盐水0.4 ml/只，1次/日；

肺积1号方小剂量组：灌服含生药1.0 g /m l的中药混悬液0.4 ml/只，1次/日；

肺积1号方中剂量组：灌服含生药2.0 g /m l的中药混悬液0.4 ml/只，1次/日；

实验对象：自家小女林思言、妻侄女林子玥、表侄儿田澎、同事及朋友孩子柯添恺、施芳瑜等十二三人。其中，六年级毕业生6人，初一学生2人，五年级4人，远在福州的侄儿通过微信凑个热闹。

肺积1号方大剂量组：灌服含生药4.0 g /m l的中药混悬液0.4 ml/只，1次/日。

连续用药14天，停药1天，接种后第21天颈部脱臼法处死各组小鼠。

1.2.2免疫组化SP法检测肿瘤组织CyclinD1表达

1.2.2.1方法

1)除顺铂组外，各组分别取部分肿瘤组织，10%福尔马林固定24小时，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，每一组织块连续4 μm切片4张；

2)按试剂盒说明书要求，滴加内源性过氧化物酶阻断剂(A液)50 μl，室温(20～25 ℃)孵育10 分钟；

3)热修复抗原:将切片浸入0.1M EDTA抗原修复液,微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10 分钟后，重复1 次，冷却后PBS洗涤2 次，甩干；

4)PBS 冲洗，3分钟×3次，甩干。滴加封闭液(B液)50μl 覆盖，室温孵育10～15 分钟。用吸水纸将封闭液吸去，勿洗，滴加50μl 一抗(兔抗鼠CyclinD1单克隆抗体)，4℃过夜；

5)PBS 冲洗，3分钟×3次，甩干，滴加二抗-HRP多聚体(C液)50 μl，室温孵育30分钟；

6)PBS 冲洗，3分钟×3次，DAB 染色；

7)自来水充分冲洗；

8)梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.2.2结果判定 以细胞核被染成棕黄色为阳性。

用试剂盒提供的阳性对照片(人乳腺癌标本)作阳性对照，PBS液取代一抗作阴性对照。运用计算机显微图像分析技术进行定量分析。在Eclipse E800型光学显微镜下, 每一张切片随机选取5个400倍视野，采用SpotAdvanced显微摄像系统拍摄照片，并用Image-pro Plus 5.0图像分析系统对CyclinD1阳性染色的平均光密度值(mean optical density, MOD)进行分析。

1.3统计学处理

2 结 果

CyclinD1抗原的阳性表达定位于移植瘤细胞核内，呈棕黄色。与模型组比较，肺积1号方中剂量组及大剂量组CyclinD1的表达明显降低(P<0.01) (见表1)。

表1 免疫组化法检测肺积1号方对CyclinD1表达的影响

注：与模型组比较，**P<0.01

3 讨 论

CyclinD是G1期主要的细胞周期蛋白，选择性的与CDK4或CDK6组成CyclinD- CDK4/6复合体，可使本来低磷酸化的Rb蛋白(retinoblastoma protein, 视网膜母细胞瘤蛋白)磷酸化，Rb蛋白被磷酸化后，不能继续结合转录因子E2F，E2F被释放而有活性，RNA转录得以进行，促进DNA复制及蛋白质合成，细胞进入增殖状态。由此可见，CyclinD可以正向调控细胞周期，对细胞的增殖有促进作用[3]。

Cyclin D有D1、D2、D3三种。CCND1是一种原癌基因，其编码的Cyclin D1蛋白在正常组织中低水平表达，而在多种肿瘤中呈过度表达，如非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等。Reissmann等[4]在非小细胞肺癌患者肿瘤组织中检测到CCND1基因扩增和Cyclin D1蛋白的过表达，且多出现在病程早期。梁瑞韵等[5]研究发现，Cyclin D1蛋白过度表达与非小细胞肺癌淋巴结转移有关，且表达阳性者生存期缩短。肖海励等[6]发现，CyclinD1的表达程度与非小细胞肺癌的分化程度、临床分期、淋巴结转移有关，而与年龄、性别、组织学类型无关。

本次研究发现，肺积1号方能够降低Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织CyclinD1的表达，推测其抗肿瘤机理可能是CyclinD1浓度下降后不足以激活CDK4或CDK6，不能形成相应的Cyclin-CDK复合体，Rb蛋白保持低磷酸化或去磷酸化状态，结合的E2F得不到释放，从而阻碍了E2F介导的mRNA转录，细胞周期停滞在G1-S节点，从而抑制肿瘤细胞的增殖。降低CyclinD1的表达，可以改善非小细胞肺癌患者的预后，课题组将进行进一步临床研究。

[1] 孙长岗, 唐世峰, 杨静, 等. 肺积1号联合化疗治疗中晚期NSCLC疗效分析[J]. 世界中西医结合杂志,2010,5(12):1046-1049.

[2] 贺珊珊, 庄静, 杨静, 等. 肺积1号方抑制la-795肺腺癌小鼠移植瘤生长的实验研究[J]. 预防医学论坛,2010,16(12):1169-1170.

[3] 乌云高娃, 刘淑萍. G1/S限制点的调控与肿瘤的发生[J]. 内蒙古医学院学报,2007,29(1):60-62.

[4] Reissmann PT, Koga H, Figlin RA, et al. Amplification and over-expression of the cyclin D1 and epidermal growth factor receptorgenes in non-small cell lung cancer.Lung cancer study group[J]. Cancer Res Clin Oncol,1999,12(5):61-70.

[5] 梁瑞韵, 廖增顺, 江山平, 等. Cyclin D1和VEGF在非小细胞肺癌组织中的表达及其与预后的关系[J]. 癌症,2003,22(1):86-90.

[6] 肖海励, 王静. CyclinD1和p27在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义[J]. 肿瘤基础与临床,2008,21(2):93-95.