软骨组织工程的研究进展

张莹莹 综述 周广东 曹谊林 审校

·综述·

软骨组织工程的研究进展

张莹莹 综述 周广东 曹谊林 审校

目前，软骨组织工程已在基础研究方面取得了令人瞩目的成果，并在临床应用方面进行了初步尝试，为临床软骨缺损的修复提供了新的思路与途径，已经成为该领域主要的研究方向，但其大规模临床应用尚存在诸多困难。现结合近年的研究成果，就组织工程化软骨的种子细胞、生物支架材料、体内外构建以及临床应用等方面进行综述。

软骨组织工程 种子细胞 支架材料 体内外构建 临床修复

先天性畸形、外伤、肿瘤等造成的软骨病变或缺损，是整形外科领域常见的疾病。我国每年因软骨缺损而需进行软骨移植手术的就超过2 000万人次。现代外科学用于修复病损组织的材料包括异种、同种异体、自体组织和人工合成材料。但是这些材料均具有局限性。

近年来，组织工程学的发展为软骨缺损的修复提供了新的思路。组织工程学的基本原理和方法，是将体外扩增的种子细胞种植于可生物降解、组织相容性好的生物材料，形成复合物并植入软骨缺损处，在生物材料自行降解的过程中，种子细胞形成新的软骨，以填充缺损[1]。软骨组织工程研究方面已取得了许多令人瞩目的成就。Rotter等[2]将人体软骨细胞种植在PLA与PGA的混合物上，移植于裸鼠体内，成功地形成了力学性能稳定、密布有微晶管的透明软骨基质；曹谊林等[3]成功再造了具有人耳廓形态的软骨组织；Shigeyuki等[4]在胶原凝胶上种植软骨细胞，用于修复大面积关节缺损。目前组织工程化软骨虽然已经初步应用于临床，但尚有许多关键问题仍有待于进一步的研究。

1 支架材料

支架材料是软骨组织工程的重要方面，理想的支架材料对于软骨的构造相当关键。支架材料分为天然生物材料与合成生物材料。天然生物材料突出的优点是其生物相容性好，材料本身就含有特殊的氨基酸序列（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，即RGD序列），能促进细胞与材料的黏附并能维持软骨细胞的分化状态，软骨细胞的生长、代谢好，能产生较多基质并形成软骨[5-6]。但是，天然材料批间差异大，难以大量工业化生产，限制了其应用。人工合成材料具有较强的可控性，可精确控制其形状、分子量、降解时间、降解率、疏水性等，从而成为组织工程重要的支架材料。聚乳酸（Polylactic acid，PLA）与聚羟基乙酸（Polyglycolic acid，PGA）和二者的共聚物，是当前软骨组织工程应用最多的支架材料[7]，可在体内水解并逐渐降解、吸收，同时软骨细胞合成胶原、蛋白多糖等胞外基质替代降解的生物材料，最终生成类似天然软骨结构的组织。曹谊林等[1]成功地在裸鼠皮下用 PGA-PLA耳型模板构建了具有精确三维结构的耳廓状软骨，揭示了组织工程技术应用的广阔前景。该实验同时也验证了PLA和PGA能够加工成具有精细结构的支架，并用于软骨细胞的体外三维培养[8]。

目前，支架材料的生物相容性、材料与细胞的亲和力、材料的降解速率与组织生成的匹配关系、降解产物的最终转归及其对机体的影响、材料的力学性能等均未得到很好解决，尚需进行更为深入的研究。

2 种子细胞

2.1 自体软骨细胞

自体软骨细胞作为种子细胞，分化程度高，分泌功能旺盛，不会产生免疫排斥反应。但是细胞来源和增殖能力有限，患者需两次手术，治疗费用昂贵且治疗周期长，使临床应用受到极大制约。

2.2 同种异体或异种软骨细胞

与自体细胞相比，来源广泛。但对于免疫排斥反应目前尚无良好的办法。

2.3 干细胞

干细胞在体外培养时可无限分裂增殖并保持其多分化潜能，且干细胞源性的软骨细胞具有获得稳定表型等优点[10]，体外研究已经证实了干细胞具有软骨分化潜能。

2.3.1 骨髓来源的间充质干细胞

骨髓间充质干细胞（Bone marrow stem cells，BMSCs）具有增殖能力强，成软骨分化能力稳定，来源广泛，取材创伤小等优势，已成为软骨构建的首选种子细胞。骨形成蛋白-2（Bone morphogenetic protein，BMP-2）和胰岛素样生长因子-1（Insulin-like growing factor，IGF-1）是目前两种已知的具有诱导BMSC向软骨细胞分化的细胞因子。Fukumoto等[11]证实了IGF-1可以诱导从骨膜分离出的MSC向软骨细胞分化并显著地促进软骨形成，而且IGF-1与TGF-B联合使用可以极强地增强早期软骨的生成。

2.3.2 胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）

主要来源于受精卵发育成的早期胚胎，也可从体细胞核移植发育的胚胎获得。ESCs是胚胎发育早期胚泡内细胞团中未分化的细胞，具有以下特点：具有受精卵的多向分化、无限增殖性能；增殖并保持未分化状态，具有全能性和形成嵌合体动物的能力；能建立稳定的细胞系，长期培养可保持高度未分化和发育潜能。因此，胚胎干细胞有望成为软骨组织工程中新的种子细胞的理想来源。Kramer等[12－13]的研究证实了ESCs在BMP-2及BMP-4作用下可分化为软骨细胞。

2.3.3 脂肪来源的间充质干细胞（ADSCs）

Ogawa等[14]将脂肪干细胞传代2次后，加入DMEM培养液，应用微球培养的方法培养4周，可以检测到aggrecan和col-Ⅱ、col-Ⅹ等基因表达，组织学染色可以发现阿丽辛蓝染色阳性细胞，这些都证明脂肪干细胞可以向软骨细胞分化。因ADSCs来源充足、获取方便、对培养基的要求低、体外扩增能力强等优点，已引起了学界的广泛关注。

2.3.4 其他来源的间充质干细胞

Wakitani等[15]培养兔胫骨膜细胞，修复兔股骨髁全层软骨缺损，24周时软骨下骨完全形成，新生软骨组织无骨化现象。Fuchs等[16]以羊脐血干细胞构建出了与天然软骨具有相似组织学特性的三维软骨。

3 体内、外构建

按培养的软骨细胞所处的空间结构分为单层培养和三维立体培养。单层培养是目前软骨细胞主要的培养方式，经过5～6次传代后，软骨细胞逐渐由三角形、多角形转变为长梭形，丧失软骨细胞的标志性表型Ⅱ型胶原蛋白，此过程称之为去分化。以往研究发现，单层培养的关节软骨细胞在培养过程中逐渐失去了典型软骨细胞的形态学特征，类似于成纤维细胞，而且Ⅱ型胶原分泌减少，失去了软骨细胞特异性，即出现了反分化。三维支架设计的最初目的也正是希望模拟细胞外基质的功能，为细胞提供分化信号，同时通过细胞与支架的黏附生长以保证单位空间的细胞密度，促进细胞的集聚，进而促进培养过程中细胞间通讯以维持其分化特性，并且还可以通过改变支架的特性引导体外培育的组织形成特定形状，以适应外科植入的需求。藻酸盐凝胶三维培养能使软骨细胞的表型维持达8个月之久，并能使去分化的软骨细胞再分化，Ⅱ型胶原重新表达，解离也相当方便。在三维立体环境下，软骨细胞的表型稳定，且更适合软骨细胞的生长、代谢，明显优于单层培养。Kuriwaka等[17]将三维培养和单层培养结合起来，希望在保证软骨细胞分化程度的前提下最大限度地扩增细胞数量。他们认为，除了模拟体内细胞在三维空间中生长的条件外，更重要的是为其提供充足的营养、氧气和适宜的物理和化学信号以及有效地排出细胞的代谢产物，以促进并维持软骨细胞的分化表型。

生物反应器综合了连续灌注培养与应力刺激培养，培养液可循环流动，并且具有一定的切应力，促进了三维支架上的软骨细胞生长。生物反应器的优点：①软骨产量较高，这样就能用相同的种植细胞量生产出更多的软骨；②良好的细胞贴附动力学及细胞的高切应力敏感性；③具有较好的软骨细胞空间分布一致性。在生物反应器内，培养液的循环流动加上转动培养，有助于直径为20～32 nm的软骨细胞聚合体形成，从而提高细胞的贴附能力，使细胞分布更趋一致。进一步的研究发现，旋转的生物反应器具有提高软骨生长和机械性能的作用。

体外培养一段时间后，将构建的组织工程化软骨植入体内，能够得到更加成熟，更趋于天然软骨的构建组织。这可能与体内的生理微环境所提供的适宜氧浓度，以及外周血供有关。同时，体内植入也能够很好的检验体外构建组织的稳定性。Wakitani等[18－19]先后证实了动物的骨髓基质干细胞复合生物支架材料，可以有效修复关节软骨缺损，而且BMSCs还可以在不同的关节微环境中分别分化为软骨细胞和成骨细胞。但是对于很多发生在皮下的软骨缺损（如耳、鼻的软骨缺损），动物实验证明皮下环境不适合BMSCs向软骨细胞分化，因此植入体内后的微生态对构建组织的存活和发挥生理功能具有非常重要的作用[20－21]。周广东等[22-23]尝试用猪和人的骨髓基质干细胞（hMSCs）在体外分别进行短时间诱导培养和长时间充分的诱导，再植入皮下进行比较，发现体外诱导时间短（4～8周）的软骨植入后易发生血管化，形成骨样或纤维样血管化组织；而通过体外12周左右的静态诱导和培养，可以构建出具有一定形态的组织工程化软骨组织，移植入裸鼠皮下后发现构建的软骨组织可以长期存活，但是不能完全保持原来的形态，显微镜下观察发现构建软骨细胞数量减少而且发生不同程度的钙化，而这种钙化可能是部分软骨发生血管化后再骨化的结果[24]，也可能是经过体外长期培养和诱导后BMSCs发生老化凋亡的结果。因此，如何抑制组织工程化软骨植入体内非软骨环境后产生的血管化，同时缩短组织工程化软骨体外培养和构建的时间，是当前亟待解决的问题。

4 临床应用研究

软骨缺损是临床常见的疑难病症之一。由于软骨的再生能力低而难以自行修复，目前临床上多采用自体或异体软骨移植、软骨膜或骨膜移植、软骨细胞移植等方法进行修复，但均因取材局限、免疫排斥等导致效果不佳。利用组织工程的方法再造软骨，为软骨缺损的临床修复提供了新的思路与途径。目前，国外已开展组织工程修复临床软骨缺损的初步探索，但仍缺乏大样本及长期随访研究，对临床应用发生的不良反应亦鲜有报道，对治疗效果的评估尚无统一的客观标准，但上述研究依然为软骨组织工程的临床大规模应用奠定了基础。

4.1 关节软骨修复方面

随着软骨组织工程基础研究的迅速发展，组织工程化软骨的临床应用研究也取得了一定的成果。Pavesio等[25]采用自体软骨细胞体外扩增后，种植至透明质酸内，治疗600例膝关节软骨缺损患者。67例进行了术后关节镜和组织学检查。结果表明，97%的患者主观评价满意，94%的患者生活质量提高。膝关节功能检查显示，87%的患者功能恢复良好；关节镜检查显示，96.7%的患者关节软骨具有良好生物学形态；组织学证实大多为透明样软骨。Visna等[26]在2000年至2002年期间，采用体外培养的自体软骨细胞和纤维蛋白凝胶治疗了19例膝关节深层软骨缺损的患者，并对14例缺损（2～10 cm，平均4.31 cm）患者中的12例进行了评估。术后5～12个月随访显示，12例患者的临床症状得到改善，Lysholm膝关节功能评分从术前的45.6提高到术后5个月时的72.0和术后12个月时的81.5；关节镜活检显示，可见典型的球形软骨细胞，退化区新生血管形成，可见成纤维细胞。

4.2 修复重建外科方面

Cherubino等[27]从1999年11月至2001年1月，采用患者自体软骨细胞及双层胶原膜三维支架，对13例软骨损伤的患者进行了修复治疗，术后随访2～15个月 （平均6．5个月），未观察到并发症，其中6例术后6个月临床症状和关节功能改善，磁共振影像显示移植部位有透明样软骨存在，关节镜活检也显示在移植表层可见成软骨细胞。Wakitani等[28]将患者自体骨髓干细胞种植至胶原凝胶上再移植，并用自体骨膜覆盖，治疗膝关节软骨缺损的1例26岁女性患者和1例44岁男性患者。移植后6个月，临床症状明显改善并有效保持。该女性患者2年、男性患者1年后，关节镜检查显示损伤部位纤维软骨修复。

4.3 气管软骨修复方面

2004年，Long等[29]将同种异体软骨细胞－PLA复合物在动物体内培养7周后行气管修补术，纤维喉镜下观察实验组2只动物。术后第4周可见气管管腔通畅，移植组织存活，气管切缘缝合处略水肿，有1只动物创缘可见肉芽组织生长。第6周和第8周检查见气管管腔通畅，无明显狭窄，移植物与气管切缘愈合良好，缝合处水肿逐渐减轻，肉芽组织逐渐消失。修补术后组织学观察显示，手术后第8周，移植处软骨组织内有炎性细胞浸润，可见大量软骨细胞及其基质，管腔一侧为纤维组织；行阿尔辛兰-丽春红染色，移植处组织标本内可见大量染色呈绿色的软骨细胞。2008年，首例应用干细胞方法培养的“人造气管”移植成功。《柳叶刀》、《新科学家》报道，一支由多国科研人员组成的医疗团队在西班牙完成了全球首例“人造气管”暨完整的“人造器官”移植手术，术后30岁女患者已彻底康复。手术共分5个步骤完成。提取捐赠气管行脱细胞处理，将患者自身干细胞注入“支架”，然后培养“新气管”，坏死气管切除，最后移植“新气管”[30]。

4.4 组织工程化软骨临床应用面临的困难

4.4.1 种子细胞的获取和诱导转化技术流程的建立和规范

包括体外细胞培养、干细胞诱导分化、组织构建和支架降解等的最适宜时间等还需进一步研究。

4.4.2 仿生化、智能化软骨组织工程生物材料的制备

从群体化治疗考虑，工程化制备组织工程软骨，应当选用同种异体种子细胞。但是，同种异体细胞的抗原性以及临床使用的安全性尚没有解决办法。另外，能完全满足组织工程要求的三维载体材料的更为深入的研究，还有待于相关学科的共同努力。

4.4.3 组织工程软骨临床应用所面临的伦理及安全性问题

组织工程化软骨在种子细胞培养和组织构建时需使用血清和大量的细胞因子，尚存在一些医学伦理问题有待解决。另外，目前尚无临床应用实验后的长期随访结果，组织工程化组织在体内的长期存在，是否会导致不利的后果仍存在一定的疑问[31-32]

组织工程产品和临床应用安全性评价与标准化是组织工程临床应用和产业化必经的重要阶段，目前从总体上看国内外对组织工程产品尚无完善的、整体的管理办法及评价方法，严重制约了组织工程产品的临床应用与产业化发展。组织工程的特点（细胞、材料与临床应用的紧密结合）决定了它不可能仅局限于现有的任何一个安全性评价体系内，必须建立专有的评价指标和评价流程。

5 展望

随着软骨组织工程研究的不断深入，以及前期临床应用实验的长期观察结果，种子细胞筛选、培养和组织构建的规范化，以及安全性评价体系的建立将是今后的研究重点。当这些问题得到了充分的研究，以及相关伦理问题得到解决，组织工程化软骨将真正应用于临床，并能解决众多的临床医学难题，而造福于人类。

[1] Tay AG,Farhadi J,Suetterlin R,et al.Cell yield,proliferation differentiation capacity of human ear,nasal,and rib chondrocytes [J].Tissue Eng,2004,10(5-6):762-770.

[2] Rotter N,Aigner J,Hammer C,et al.Behavior of tissue-engineered human cartilage after transplantation into nude mice[J].J Mater Sci Mater Med,1999,10(11):689-693.

[3] Cao Y,Vacanti JP,Paige KT,et al.Transplantation of chondrocytes utilizing a polymer-cell construct to produce tissue-engineered cartilage in the shape of a human ear[J].Plast Reconstr Surg, 1997,100(2):297-302.

[4] Shigeyuki W,Wakitani TG,Randell GY,et al.Repair of large full-thickness articular cartilage defects with allograft articular chonrocytes embedded in a collegen gel[J].Tissue Eng,1998,4(4): 429-443.

[5] Williams CG,Kim TK,Taboas A,et al.In vitro chondrogenesis of bone marrow derived mesenchymal stem cells in a photo polymerizing hydrogel[J].Tissue Eng,2003,9(2):679-688.

[6] Murphy CL,Sambanis A.Effect of oxygen tension and alginate encapsulation on restoration of the differentiated phenotype of passaged chondrocytes[J].Tissue Eng,2001,7(1):791-803.

[7] Shin’oka T.Mid-term clinical results of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells[J].Yon sei Med J,2004,5(5):73-74.

[8] Cohen SB,Meirisch CM,Wilson HA,et a1.The use of absorbable co-polymer pads with alginate and cells for articular cartilage ear in rabbits[J].Biomaterials,2003,24(15):2653-2660.

[9] He QY,Li QH,Yang L,et al.Immortalization of human articular chondrocytes and induction of their phenotype[J].Chin Med J, 2003,116(9):l 351-l 356.

[10] Hegert C,Kr J,Hargus G,et a1.Differentiation plasticity of chondrocytes derived from mouse embryonic stem cells[J].J Cell Sci,2002,15(23):4617-4628.

[11] Davidson D,Blanc A,Filion D,et a1.Fibroblast growth factor (FGF)signals through FGF receptor 3 to promote chondrogenesis [J].J Biol Chem,2005,280(21):20509-205l5.

[12] Atala A.Tissue engineering and regenerative medicine:concepts for clinical application[J].Rejuvenation Res,2004,7(1):15-31.

[13] Thomson JA,Itskovitz-Eldor J,Shapiro SS,et a1.Embryonic stem cell lines derived from human blastocytes[J].Science,1998,282 (5391):1145-1147.

[14] Ogawa R,Mizuno H,Watanabe A,et a1.Osteogenic and chondrogenic differentiation by adipose-derived sten cells harvested from GFP transgenic mice[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,313(4): 871-874.

[15] Wakitani S,Goto T,Pmeda SJ,et a1.Multipotent mesenchymal stem cells from adult rabbits synovial membrane[J].J Bone Joint Surg,2004,76(3):579-592.

[16] Fuchs JR,Hannouche D,Terada S,et a1.Cartilage engineering from ovine umbilical cord blood mesenchymal progenitor cells[J]. Stem Cells,2005,23(7):958-964.

[17] Wang Y,Blasioli DJ,Kim HJ,et a1.Cartilage tissue engineering with silk scaffolds and human articular chondrocytes[J].Biomaterials, 2006,27(25):4434-4442.

[18] Wakitani S,Goto T,Pineda SJ,et al.Mesenchymal cell-based repair of large,full-thickness defects of articular cartilage[J].J Bone Joint Surg Am,1994,76(4):579-592.

[19] Grande DA,Southerland SS,Manji R,et al.Repair of articular cartilage defects using mesenchymal stem cells[J].Tissue Eng, 1995,1(4):345-353.

[20] 周广东,苗春雷,王晓云,等.软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外软骨形成的实验研究[J].中华医学杂志,2004,84(20):1716-1720.

[21] Angele P,Kujat R,Nerlich M,et al.Engineering of osteochondral tissue with bone marrow mesenchymal progenitor cells in a derivatized hyaluronan-gelatin composite sponge[J].Tissue Eng,1999,5(6): 545-556.

[22] Liu TY,Zhou GD,Liu W,et al.Cartilage construction in special shapes with bone marrow stromal cells and biodegradable scaffolds [J].Tissue Eng,2006,12(4):1010-1011.

[23] Liu K,Zhou GD,Liu W,et al.Chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in PLA coated PGA discs in vitro by different concentration of TGF-beta 1 induction[J]. Tissue Eng,2006,12(4):1012-1013.

[24] Liu K,Zhou GD,Liu W,et al.The dependence of in vivo stable ectopic chondrogenesis by human mesenchymal stem cells on chondrogenic differentiation in vitro[J].Biomaterials,2008,29(14): 2183-2192.

[25] Pavesio A,Abatangelo G,Borrione A,et a1.Hyaluronan-based scaffolds(Hyalo graft C)in the treatment of knee cartilage defects: preliminary clinical findings[J].Novartis Found Symp,2003,249 (2):203-241.

[26] Visna P,Pasa L,Hart R,et a1.Treatment of deep chondral defects of the knee using autologous chondrocytes cultured on a support results after one year[J].Acta Chir Orthop Traumatol Cech,2003, 70(6):356-362.

[27] Cherubino P,Grassi FA,Bulgheroni P,et a1.Autologous chondrocyte implantation using a bilayer collag en membrane:a preliminary report[J].J Orthop Surg,2003,11(1):10-15.

[28] Wakitani S,Mitsuoka T,Nakamura N,et a1.Autologous bone marrow stromal cell transplantation for repair of full thickness articular cartilage defects in human patellae:two case reports[J].Cell Transplant,2004,13(5):595-600.

[29] Long CM,Conley SF,Kajdacsy-Balla A,et al.Laryngotracheal reconstruction in canines:fixation of autologous costochondral grafts using polylactic and polyglycolic acid miniplates[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg,2004,127(5):570-576.

[30] Macchiarini P,Jungebluth P,Go T,et al.Clinical transplantation of a tissue-engineered airway[J].Lancet,2008,372(9655):2023-2030.

[31] Pan Y,Bender PK,Akers RM,et a1.One or more serum factors promote peptide utilization in cultured animal cells[J].J Nutr, 1998,128(4):744-750.

[32] 宋克群,李玉珍,王琦.试论人类体细胞基因治疗的生命伦理[J].医学与哲学,1998,19(1):43-44.

Research Progress of Cartilage Tissue Engineering

ZHANG Yingying,ZHOU Guangdong,CAO Yilin.

Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHOU Guangdong(E-mail:guangdongzhou@126.com).

【Summary】At present,cartilage tissue engineering has made resounding achievements in basic research,and has been applied to preliminary clinical practice which showed a promising approach for repair of cartilage defect.However,as to clinical application in the future,many difficulties remained.This review covered both the current situation of the research development in cartilage tissue engineering (seeding cells,bio-scaffolds,in vitro and in vivo construction)and the obstacles of its clinical application．

Cartilage tissue engineering; Seeding cells;Bio-scaffolds; In vitro and in vivo construction; Clinical repair

Q813.1+2

B

1673－0364（2011）06－0340－04

2011年8月4日；

2011年9月12日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.06.013

国家自然科学基金项目 （30772264,50830105, 30973131）；上海市曙光计划项目（08SG19）；上海市启明星计划跟踪项目（09QH1401600）。

200011 上海市 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

周广东（E-mail:guangdongzhou@126.com）。