棉籽粕多菌种固体发酵条件的响应面优化研究

葛洪 张占军 房诗宏 张媛媛

棉籽粕是棉籽提取棉籽油后的副产品，粗蛋白质含量可高达53%，仅次于豆粕，是重要的植物性蛋白质资源之一[1]。棉籽粕是广泛应用于饲料工业的蛋白源。但由于棉籽粕中含有游离棉酚等抗营养因子、氨基酸比例不均衡、棉籽结构致密造成的适口性差和消化率偏低等因素限制了其应用[2]。目前，应用发酵技术处理棉籽粕，是有效提高棉籽粕品质的方法之一。在发酵过程中还可以产生直接被动物吸收的小肽和其他多种生物活性物质，这对动物的生长十分有利。同时，在发酵过程中会产生呈味物质，这对于幼龄动物，具有明显的诱食效果。此外，由于部分碳水化合物被降解，棉籽粕致密结构变得疏松，适口性将显著提高。

响应面优化法是20世纪90年代初从西方兴起的一种试验统计方法,它包括了试验设计、建模、检验模型的有效性、筛选最佳组合条件等众多试验和统计技术,通过对方程的回归拟合和响应曲面、等高线的绘制，可方便地求出相应于各因素水平的响应值[3-4]。应用响应面法对工艺条件进行设计和优化,可获得最佳工艺，了解生产过程中各因素的影响和交互作用,为试验的改进和生产工艺标准的制订提供可靠的数据[5]。

本研究利用热带假丝酵母、红曲霉和枯草芽孢杆菌对棉籽粕进行混合菌固体发酵，以棉籽粕中游离棉酚为评价指标，在发酵时间、接种量、发酵温度等单因素试验基础上，利用响应面分析法优化棉籽粕多菌种固体发酵的工艺条件，旨在为进一步开发和利用棉籽粕资源及工业化发酵生产提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 棉籽粕

由德州中钿生物科技有限公司提供，粗蛋白含量49.90%，游离棉酚含量842 mg/kg(数据由本实验室按照饲料中粗蛋白测定方法GB/T 6432—94及饲料中游离棉酚测定方法GB13086—91测定)；麸皮为市售。

1.1.2 菌种

红曲霉由本实验室从红曲米中自主筛选得到；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及热带假丝酵母(Candida tropicalis)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.3 培养基

1.1.3.1 斜面培养基

LB培养基:牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂15～20 g、水1 000 ml，pH值7.0～7.2。

YPD培养基：酵母膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g，加水1 000 ml。

1.1.3.2 液体种子培养基(LB液体培养基)

牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、水1 000 ml，pH值7.0～7.2。

1.1.3 .3三角瓶棉籽粕发酵培养基

棉籽粕44%、麸皮10%、尿素2%、水分44%（即按料液比1∶1，g/ml），装量50 g/250 ml，封口，121℃灭菌15 min。

1.1.4 主要仪器和设备

岛津UV-260型分光光度计（日本岛津有限公司）、恒温摇床（伊孚森INFORS生物技术有限公司）；恒温培养箱（德国MEMMERT进口培养箱）；电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；凯氏定氮仪（KDY-9820，北京市通润源机电技术有限公司）；控温型远红外消煮炉（四平电子研究所）；分析天平（上海恒平科学仪器有限公司）；高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；3-氨基-1-丙醇[阿拉丁试剂有限公司（进口分装）]，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 液体种子制备

将活化好的红曲霉菌种从斜面培养基接种到装有100 ml豆芽汁种子培养基的250 ml三角瓶中，在恒温摇床中30℃培养5 d后转移到冰箱中备用；将活化好的枯草芽孢杆菌菌种从斜面培养基接种到装有100 ml LB液体种子培养基的250 ml三角瓶中，恒温摇床中30℃培养18 h后转移到冰箱中备用；将活化好的热带假丝酵母从斜面培养基接种到装有100 ml豆芽汁种子培养基的250 ml三角瓶中，在恒温摇床中30℃培养20 h后转移到冰箱中备用。

1.2.2 测定项目与方法

饲料中粗蛋白测定方法采用GB/T 6432—94；饲料中游离棉酚测定采用GB13086—91。1.2.3混菌三角瓶发酵单因素试验

采用红曲霉、枯草芽孢杆菌及热带假丝酵母比例为1∶1∶1的混合菌种进行三角瓶棉籽粕发酵试验，分别采用不同的接种量、不同的发酵温度、不同的发酵时间进行单因素试验。发酵产品60℃下烘干后，测定发酵产品中的粗蛋白及游离棉酚含量。

1.2.4 混菌三角瓶发酵优化试验

采用Design Expert 7.0.0软件对影响发酵去除游离棉酚的几个因素的参数作响应面优化，以便改进棉籽粕固体发酵工艺。

2 结果与分析

2.1 单因素对棉籽粕发酵脱除棉酚的影响

2.1.1 接种量对棉籽粕发酵脱除棉酚的影响

在采用红曲霉、枯草芽孢杆菌及热带假丝酵母比例为1∶1∶1的混合菌种进行三角瓶棉籽粕发酵试验时，固定发酵温度30℃，发酵时间72 h的条件下，分别按5%、10%、15%、20%和25%的接种量接种至三角瓶进行棉籽粕固体发酵并测定其游离棉酚的含量，结果见图1。

图1 接种量对棉籽粕发酵脱除棉酚的影响

由图1可见，在接种量较低时，菌种浓度过低致使发酵不完全，导致游离棉酚含量较高。当接种量增大到10%时，游离棉酚下降最多，此时游离棉酚只有(126.26±16.73)mg/kg。此后随着接种量的增大，游离棉酚并未呈显著的下降，当接种量达25%时，游离棉酚含量反而增加，可能是由于湿度过大，影响了发酵的进行。因此，在优化试验中，选择10%接种量为优化中心点。

2.1.2 发酵温度对棉籽粕发酵脱除棉酚的影响

在采用红曲霉、枯草芽孢杆菌及热带假丝酵母比例为1∶1∶1的混合菌种进行三角瓶棉籽粕发酵试验时，改变发酵温度，而固定发酵时间72 h和采用10%的接种量的条件下，接种至三角瓶进行棉籽粕混合菌种固体发酵并测定游离棉酚的含量，结果见图2。

图2 发酵温度对棉籽粕发酵脱除棉酚的影响

从图2可以看出，随着发酵温度的升高，棉籽粕中游离棉酚逐渐减少，至30℃时游离棉酚最低，此后温度升高，游离棉酚含量不再减少反而有所升高。综合能耗情况，选择30℃为温度优化中心点。

2.1.3 发酵时间对棉籽粕发酵脱除棉酚的影响

在采用红曲霉、枯草芽孢杆菌及热带假丝酵母比例为1∶1∶1的混合菌种进行三角瓶棉籽粕发酵试验时，固定发酵温度30℃和采用10%的接种量的条件下，观察不同发酵时间后发酵底物中游离棉酚的含量，结果见图3。

图3 发酵时间对棉籽粕发酵脱除棉酚的影响

由图3可以看出，随着发酵时间的延长，发酵进行的越彻底，游离棉酚含量下降的越明显，但方差分析表明，发酵时间为72 h和84 h游离棉酚下降差异并不显著，考虑到成本因素，选取72 h为发酵时间优化中心点。

2.2 响应面试验优化

2.2.1 试验设计与结果

响应面法以最经济的方式、较少的试验次数和较短的时间对所选的试验参数进行全面研究[6]。根据单因素试验结果，选取接种量(X1)、发酵温度(X2)和发酵时间(X3)3个因素作为响应变量，以游离棉酚含量为响应值，利用Design-Expert 7.0.0 Trial软件按照Box-Behnken原理[7]进行响应面设计，优化棉籽粕固体发酵工艺，以1、0、-1分别代表自变量的3个水平，试验因素及水平编码如表1所示。

表1 Box-Behnken响应面试验设计因素和水平

具体试验设计方案及结果见表2，设计了17个试验点的响应面分析试验，其中12个析因点，零点试验进行了5次以估计误差。

表2 Box-Behnken设计模型及试验值

2.2.2 多菌种固体发酵工艺回归模型的建立及方差分析

利用Design-Expert 7.0.0软件对表2中的试验数据进行回归分析，得到游离棉酚含量对以上3个因素的回归方程为：

游离棉酚含量=121.32-76.68X1-86.48X2-63.56X3-50.32X1X2-33.78X1X3+4.48X2X3+111.00+191.40+64.85，对回归模型进行方差分析，结果见表3。

由表3可以看出:模型F值为157.10，P＜0.000 1，表明模型是高度显著的[8]；模型的失拟项P=0.060 4＞0.05，表明失拟不显著，即该模型是稳定的[9]，能较好地预测实际发酵后游离棉酚的下降情况。模型一次项X1、X2及X3均极显著，且显著顺序是X2(发酵温度)＞X1(接种量)＞X3(发酵时间)；二次项均极显著，交互项除X2X3外均极显著，表明各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

表3 回归模型方差分析

2.2.3 响应面分析及优化

通过Design-Expert 7.0.0软件进行各因素间交互作用对游离棉酚值的响应面分析。利用软件做出中心组合设计试验所得的响应面曲面图(见图4～图6)。响应面图形是特定的响应值Y对应的因素X1、X2、X3构成的一个三维空间在二维平面上的等高图，可以直观地反映各因素的交互作用以及对响应值的影响[10]。从响应面分析图4～图6中可以看出响应值与影响因素的关系。等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反[11]。比较3组等高线图可直观地看出：X1X2、X1X3之间的交互作用显著,等高线呈椭圆形，而X2X3等高线呈圆形，说明其交互作用不显著，这与方差分析结果一致。从响应面图可以看出此试验模型都能够达到极值点，且稳定点是最小值，即为发酵后游离棉酚含量最少的点。

图5 接种量(X1)和发酵时间(X3)交互作用的等高线和响应面图

图6 发酵温度(X2)和发酵时间(X3)交互作用的等高线和响应面图

为进一步确定使游离棉酚含量最少的最佳点，通过Design-Expert软件，设置游离棉酚含量最小值为目标，优化最终发酵工艺条件X1为0.65、X2为0.20、X3为0.34，此条件下游离棉酚含量最低为81.04 mg/kg。根据变量赋值公式χ=(Xi-X0)/ΔX可求得最终棉籽粕固体发酵工艺条件为：接种量13.25%、发酵温度31℃、发酵时间76.08 h。

2.2.4 模型的验证

为了检验模型预测的准确性，在上述优化条件下共重复4次平行验证试验，同时考虑到实际操作方便，此工艺条件进一步简化为接种量13%、发酵温度31℃、发酵时间76 h。以此条件进行多菌种固体发酵后测定游离棉酚的含量，测得此条件下实际游离棉酚含量为(82.03±3.14)mg/kg，与模型预测值78.89 mg/kg相比无明显差异，证明了方程的可靠性和响应面分析方法的有效性。

3 结论

采用试验设计软件Design-Expert 7.0.0，通过Box-Behnken中心组合试验设计得到了多菌种固体发酵棉籽粕与接种量、发酵温度和发酵时间关系的回归模型,经验证该模型是合理可靠的,能够较好地预测经发酵后棉籽粕中游离棉酚的降低量。同时利用模型的响应面及等高线，对影响游离棉酚下降的关键因素及其相互作用进行了探讨,得到的棉籽粕固体发酵工艺条件为：接种量13%、发酵温度31℃、发酵时间76 h。进一步试验证明，采用响应面分析法对棉籽粕多菌种固体发酵工艺进行优化是非常有效的。该研究结果为棉籽粕的固体发酵工艺开发提供了一定的理论基础和参考价值。

[1] 叶明强,王红梅,邝哲师,等.固体发酵棉籽粕菌种组合的筛选[J].中国饲料,2009(15):8-14.

[2] 张文举,许梓荣,孙建义,等.假丝酵母ZD-3与黑曲霉ZD-8复合固体发酵对棉籽饼脱毒及营养价值的影响研究[J].中国粮油学报,2006(6):129-134.

[3] Lee W,Yusof S,Hamid N,et al.Optimizing conditions for hot water extraction of banana juice using response surface methodology(RSM)[J].Journal of Food Engineering,2006,75(4):473-479.

[4] Sun Y,Liu J,Kennedy J F.Application of response surface methodologyforoptimizationofpolysaccharidesproduction parameters from the roots of Codonopsis pilosula by a central composite design[J].Carbohydrate Polymers,2010,80(3):949-953.

[5] 王永贵,郭俊英,张晓露,等.响应面优化法研究蔗糖苯酚树脂胶粘剂的合成[J].化工新型材料,2011(1):113-116.

[6] 李炳辉,陈玲,李晓玺,等.超声强化响应面法优化知母多糖的提取工艺[J].现代食品科技,2011(4):432-436.

[7] Box G E P,Behnken D W.Some new three level designs for the study of quantitative variables[J].Technometrics,1960,2:455-475.

[8] 宋燕,罗松明,向建军,等.响应面法优化花椒籽不可溶性膳食纤维提取工艺研究[J].中国油脂,2011(7):62-67.

[9] 任天宝,马孝琴,徐桂转,等.响应面法优化玉米秸秆蒸汽爆破预处理条件[J].农业工程学报,2011(9):282-286.

[10] 申小丽,热那汗·买买提,范少丽,等.响应面法玉米蛋白粉纯化条件优化[J].食品工业,2011(8):7-10.

[11] 张峰,仇农学.响应面法优化超声波辅助提取辣椒籽油及脂肪酸组成分析[J].中国油脂,2008(11):38-43.