血凝抑制试验检测犬血清中乙脑抗体

贾杏林,黎摄儿,谢军芳,牛俊超 ,李晓云

(湖南农业大学动物医学院,湖南长沙410128)

乙型脑炎 (JE)是一种人畜共患传染病,引起人的神经系统疾病和猪的繁殖障碍性疾病[1]。随着社会经济的发展,近年来宠物作为伴侣动物日益成为人们生活的一部分。小动物临床诊疗中发现一些神经症状患犬经犬瘟热检查结果为阴性,以及一些公犬睾丸肿大,具有乙脑的症状,因而宠物是否携带乙脑病毒、是否发生乙脑疾病成为一个需要研究的课题,但目前该方面研究报道较少。为此,本研究采用传统的血凝抑制试验检测了34份犬的血清抗体,现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试剂为某宠物医院就诊的宠物犬血清34份;乙脑血凝抑制试验诊断试剂购自云南流行病学防治研究所;乙脑阳性血清采用乙脑弱毒疫苗免疫犬3次制备 (HI效价为1∶40);乙脑阴性血清采自临床健康犬 (HI结果为阴性);生理盐水、p H7.4PBS,pH 9.0硼酸盐缓冲液、p H6.4磷酸盐缓冲液、12.5%高岭土悬液采用常规配制;40%的鸽红细胞悬液和0.5%鸽红细胞悬液用p H 6.4磷酸盐缓冲液配制。

1.2 试验方法

(1)血凝试验 首先用pH 9.0硼酸盐缓冲液2 mL充分溶解乙脑血凝素抗原,混匀,4℃过夜,3 000 r/min离心20 min,取上清液作为血凝素抗原;加入pH 9.0硼酸盐缓冲液于清洁干燥96孔V型微量板中,每孔25μL。再加入25μL乙脑血凝素于第一孔中,倍比稀释,使血凝素充分混匀,最后1孔混匀后弃掉25μL。最后每孔中加入25μL 0.5%的鹅红细胞溶液,充分混合,室温1 h后判断结果。

结果判定:++++为一层粉红色的红细胞均匀分散于孔底;+++基本同上,但边缘不整齐有下垂趋势;++为红细胞于孔底形成环状,环中央内径3 mm以上;+为红细胞于孔底形成一个圈,但边缘不光滑,四周有小凝集块;-为红细胞于孔底形成圆点。以50%红细胞出现凝集 (++)时,血凝素的最高稀释度为4个单位的血凝素单位。

(2)血清处理 首先取0.1 mL血清加12.5%高岭土溶液0.9 mL,混合后放室温中20 min,然后2 500 r/min离心15 min,加入40%鸽红血细胞悬液 (用p H6.4磷酸盐缓冲液配制)0.1 mL,振荡混匀,在37℃吸附1 h,然后1 500 r/min离心10 min,直至其不凝集0.5%鸽红细胞,上清液即为HI试验血清 (1∶10)。

(3)血凝抑制试验 乙脑血凝抑制试验按文献 [2]的方法进行:用12.5%高岭土溶液及40%鸽红细胞溶液吸附待检血清,直至完全不凝集0.5%鸽红细胞,HI试验采用4个单位的血凝素。加入pH 9.0硼酸盐缓冲液于清洁干燥96孔V型微量板中,每孔25μL。再加入1∶10血清25μL于清洁干燥96孔V型微量板中于第一孔,倍比稀释,充分混匀,最后一孔弃掉25μL。再于每孔中加入25μL血凝素,充分混匀,加盖置室温1 h。最后于每孔中加入0.5%的鸽红细胞悬液50μL,充分混合,室温1 h后判断结果。结果判定:HI效价大于1∶20判为阳性。实验孔全部呈现+++和++++的红细胞凝集为阴性结果,阳性结果以++凝集孔作为该份血清的终点抑制效价。

2 结果与分析

从表1可知,34份被检血清中,阳性血清21份,占总数61.8%;20份血清血凝抑制效价在1∶20～1∶80之间,占阳性血清的95.2%。

表1 34份犬血清中乙脑抗体检测结果

3 讨论

犬是人类伴侣动物,随着我国城市化进程加快和社会经济的发展,其数量不断增加,与人类关系愈来愈密切,其是否感染乙脑是一个值得研究的课题,目前尚未见到研究报道。本研究在犬血清中检出了流行性乙型脑炎抗体,且阳性率较高,提示存在犬感染乙脑病毒的可能性,因此,有必要作进一步研究和探索。

乙脑是以脑实质炎症、神经原变性、坏死为主要病理特征的中枢神系统疾病,从大脑到脊髓都可被侵犯[3]。在检测的临床样本中,8只病犬出现神经症状,但犬瘟检测为阴性,乙脑检测为阳性,经问诊犬只未进行过乙脑疫苗注射,因而可能为乙脑病毒侵害了犬的神经系统而引起了神经症状。

乙脑血凝抑制试验可以很好地用来检测乙脑炎病毒野毒感染产生的血凝素抗体效价,具有简便、快速、灵敏、准确等特点,因而本试验采用了该方法。但犬血清非特异性凝集较多,在试验中发现用30%鸽红细胞悬液处理犬血清后仍有一部分犬血清中非特异性凝集未消除,便将浓度提高到40%[3],消除了大部分被检犬血清与0.5%的鸽红细胞悬液的凝集情况,还有一些犬血清非特异性凝集仍未消除,采用鸽红细胞泥进行吸附,这样既没有改变待检血清的体积,又消除了血清中非特异性凝集。

[1]殷 震,刘景华.动物病毒学 (第2版)[M].北京:科学出版社,1997.633～641.

[2]自登云,陈伯权,俞永新.虫媒病毒与虫媒病毒病 [M].昆明:云南科技出版社,1994.151～155.

[3]Jia Xinglin,Chen Huanchun,Wang Xiang,etal.Quantitativeand qualitative study of Enzyme-linked Immunosorbent Assay to detect IgG against Japanese Encep halitis Virus in swine sera[J].Veterinary Research Communications,2005,29:159～169.