非小细胞肺癌患者外周血循环内皮干细胞的检测及其临床意义

刘世国,陈 鹏,郑 红,严春潮,吴 琼,龚 菲,岑千红

（湖北省中山医院检验科,湖北武汉 430033）

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）是一类来源于骨髓、增殖分化为血管内皮细胞的前体细胞。研究发现肿瘤靠血管新生来获得其脉管系统,其机制是通过已有的毛细血管形成新生血管[1]。然而近年来的研究发现,肿瘤也可以通过骨髓来源的EPCs分化为成熟的内皮细胞后进一步形成肿瘤血管[2,3]。研究表明,血管内皮细胞的前体细胞内皮祖细胞在肿瘤机体内的含量明显增高,其水平与活性与肿瘤的进展和治疗相关。因此,这些内皮干细胞在肿瘤形成中的作用及肿瘤治疗中的监测成为肿瘤研究的新领域。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集我院2008年9月至2009年8月期间非小细胞肺癌患者的外周血,采集血液标本时用EDTA抗凝管。其中,非小细胞肺癌患者组共45例,男性30例,女性15例,年龄53-84（61.3±7.5）,健康对照组15例。

1.2 实验试剂

人纤维连接蛋白购于Chemicon公司;EBM-2培养基、SingleQuots组合添加剂购自Clonetics公司;Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL）购于Molecular probes公司。ADMA,FITC标记荆豆凝集素I（FITC-UEA-I）,购于Sigma公司。PE-CD133,PEKDR购于德国MACS;TR IZOL购于晶美公司;optiL-yse C购于Sigma公司。

1.3 流式细胞仪检测EPCs

在100μl含EDTA的外周血中加入Phycoerythrinconjugated anti-human VEGFR2（R&D systems）、或 biotin-conjugated anti-human CD133（Miltenyi Biotec）4℃反应30分钟,然后加入2ml红细胞裂解液处理20分钟,用PBS洗涤。在CD133的反应管中继续加入streptavidin-PECy5（BD Biosciences）反应30分钟。同时取100μl的外周血加入相应荧光素标记的抗体作为同型对照,具体操作步骤同上。在1小时内用流式细胞仪检测。

1.4 Real-time RT-PCR检测EPCs标记分子

将外周血用红细胞裂解液（Sigma,Munich,Germany）裂解15分钟,离心后去掉上清,根据说明用Trizol reagent（Life Technologies）提取总RNA。其中逆转录反应体积为10μl,5xPrime Script Buffer 2μl,Prime Script RTEnzyme 0.5 μl,oligo dT 0.5 μl,Random 6mers 0.5 μl,total RNA 4 μl,加 RNase Freed H2O 至总体积10μl。37℃15min,85℃5 s。CD133上游引物序列为 5′-GCAATCTCCCTGTTGGTGAT-3′和下游引物 5′-CGCCTTGTCCTTGGTAGTGT-3′,VEGFR2 上 游引物序列为 5′-CACCACTCAAACGCTGACATGTA-3′和5′-GCTCGTTGGCGCACTCTT-3′。内参 β-actin 的上游引物为 5′-TCTGGCACCACACCTTCTAC-3′和下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。 荧 光 定 量PCR反应体系总体积25μl,包括上游引物（10μmol/L）0.5μl,下游引物（10μmol/L）0.5μl,2xSYBR Premix Ex TaqTM 12.5μl,模板 cDNA 溶液2μl,反应条件经优化最后确定为:预变性95℃10 s,1个循环;95℃5 s,55℃20 s,72℃12 s,40循环。

1.5 内皮祖细胞分离培养及鉴定

取外周血2 0m l,注入已加EDTA的抗凝离心管,摇匀,4 h内处理标本。采集到的外周血20m lPBS对倍稀释混匀。加入到淋巴细胞分离液。加入时小心与淋巴细胞分离液保持一界面,以2 000 r/min离心20min。离心后吸出灰白色的单个核细胞,小心吸取第二层乳白色液体于离心管中,并加以PBS液洗细胞,再以2 000 r/min离心3次。用吸管吸取上清,EGM-2 culturemedium（Clonetics Inc）,以2×106/ml浓度接种在用已用100μg/L纤维连接蛋白包被的6孔板中。第4天和第7天更换培养基。在培养细胞中加入5μg/m l的DiI-Ac-LDL,37℃孵育3小时,用PBS洗涤。用4%多聚甲醛固定细胞10分钟。浸洗,将FITC-UEA-1（10mg/L）加于上述标本,于37℃下孵育1小时。在荧光显微镜下观察并照相记录。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 非小细胞肺癌患者及健康人外周血EPCs的含量的检测

虽然到目前对EPC还没有明确的概念,根据最近几年的研究,我们用流式细胞技术检测CD133+和VEGFR2+表达情况,并把CD133+和VEGFR2+双阳性细胞确定为EPCs（见图1A）。在健康对照组中,外周血中EPCs的数量为（435±58.5）/ml,在非小细胞肺癌患者EPCs的数量为（1,365.4±225.6）/m l,相对于对照组大幅提高（P＜0.01）。

图1 流式细胞术检测外周血EPC数量

2.2 用real-time RT-PCR检测EPC表面特异性标记分子

CD133和VEGFR2是EPC表面的特异性标记分子,为了进一步从RNA水平检测其表达量,其相对表达量计算公式为:目的基因的相对表达水平=2-△△CT,△△CT=△CT（sample）-△CT（control）,△CT（sample）=CT（target gene）-CT（β-actin）。通过real-time RT-PCR检测发现,非小细胞肺癌患者外周血中CD133mRNA水平是是正常对照的3.2倍（P＜0.01）。VEGFR2的mRNA水平是正常对照的4.5倍,（P＜0.01）。

2.3 EPCs的染色与鉴定

从患者外周血分离获得的单个核细胞培养7 d后形成了梭形的内皮样细胞。用acLDL-DiI和UEA-I对细胞染色后,通过共荧光显微镜鉴定,细胞摄取FITC-UEA-1后显绿色荧光（图3A）,发红色荧光的为acLDL-DiI阳性细胞（图3B）,acLDL-DiI和UEA-I双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPCs（图3C）。

（P＜0.01,vs the controlgroup）图2 外周血中CD133和VEGFR2的mRNA相对表达水平

A:EPCs combined with FITC-UEA-1;B:EPCs combined with Dil-acLDL;C:Mergeof FITC-UEA-1 and Dil-acLDL.图3 EPCs的 Dil-acLDL和 FITC-UEA-1染色

3 讨论

血管生成在肿瘤的进展中至关重要,当一个肿瘤组织生长达到一定体积时,其微环境已不能满足肿瘤生长所需求的营养,此时会诱使肿瘤细胞启动所谓的“血管形成开关”[4],通过促使原血管生成蛋白的表达,使原先存在的毛细血管扩散,导致新血管形成。有研究发现骨髓来源的外周血EPCs在肿瘤血管形成中发挥重要作用[5-7],最近有多组研究在人类肿瘤血管中发现了CD133的EPC,且多种肿瘤患者外周血中EPC的水平上升,如、肝癌[8]、乳腺癌[9]、淋巴瘤[10]等。故将EPC作为评估恶性肿瘤诊断和治疗效果的一个可考虑应用的候选标志物。虽然对CEPs还没有明确的定义,外周血中的血管内皮细胞及其前体细胞的鉴定,同样借助于细胞表面的特异性标志。EPC表达内皮细胞的细胞标志物,如血管内皮生长因子受体 （VEGFR）,VE-cadherin、CD31、CD34、CD146等。目前较公认的 EPC为CD133+CD34+VEGFR2+细胞,而随着EPC发育为成熟内皮细胞,CD133表达逐渐下降。因此,CD133是EPC独特的细胞标志物,可以用于EPC与成熟内皮细胞的鉴别[11]。因此,我们选择CD133、VEGFR2作为CEPs的表面标志。

本研究检测了45例非小细胞肺癌患者及15例正常人外周血中的CEPs,通过用acLDL-DiI和UEA-I对细胞染色后,荧光显微镜检测证实了外周血中CEPs的存在;流式细胞技术分析发现非小细胞肺癌患者CEPs含量高于正常对照组（P＜0.01）,为进一步证实非细胞肺癌患者外周血中CEPs含量的差异,我们用Real-timeRT-PCR检测EPCs标记分子CD133和VEGFR2表达水平。其结果显示,和正常对照组比较,EPCs标记分子表达量均有不同程度的增高。因此在监测和诊断非小细胞肺癌时EPC有可能作为一种新的辅助诊断工具,同时该研究为今后将EPCs作为预后和预测化疗之后附加的抗血管治疗效果的一个选择性标记奠定基础。

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