壳聚糖鼻腔给药毒性研究

陈新梅

(山东中医药大学药学院，山东 济南 250355)

鼻腔给药作为一种新的给药途径日益受到人们的关注，鼻腔给药对蛋白质、多肽类药物、基因药物、口服难吸收药物及口服有首过效应的药物是一种有前景的给药途径［1］。由于鼻腔纤毛的清除功能，药液在鼻腔的滞留时间仅15～30min，粉末和颗粒在鼻腔的总接触时间是20～30min，在一定程度上影响了药物的吸收和疗效。为降低鼻腔清除率，延长药物滞留时间来增加吸收量，常加入生物黏附剂［2］，如CMC－Na、HPMC、明胶、淀粉、壳聚糖等，其中壳聚糖［3］以生物相容性好、毒性低、可控制药物的释放、改善易降解物质的生物利用度、增强亲水性药物通过上皮层的渗透性等优势在药剂学中得到广泛应用［3］。壳聚糖的脱乙酰度，即壳聚糖分子中脱除乙酰基的糖残基数占壳聚糖分子中总的糖残基数的百分数，是评价壳聚糖质量的一个重要指标，直接关系到壳聚糖在稀酸中的溶解能力、富集离子的能力、离子交换能力等。本试验考察了不同脱乙酰度的壳聚糖的鼻腔毒性。

1 仪器与材料

1.1 仪器 AO(双目)光学显微镜(American Optical公司);ASP300型自动脱水机(LEICA公司);EG1160型包埋机(LEICA公司);RM2135型切片机(LEICA公司);鼻腔给药喷雾瓶(苏州万通定量阀公司)。

1.2 药品与试剂 壳聚糖(山东奥康生物科技有限公司，脱乙酰度分别为 82.8%、85.4%、88.5%、91.1%、92.1%、95.4%);去氧胆酸钠(生化纯，上海伯奥生物科技有限公司，批号:030208)。其余试剂均为分析纯。

1.3 实验动物 健康成年SD大鼠，雌性，体重(250±50)g;蟾蜍45～85 g，雌雄兼用。所有动物均由山东中医药大学动物中心提供，动物证号:SYXK(鲁)20050043。

2 方法

2.1 在体蟾蜍上腭法研究壳聚糖对纤毛运动的影响 将蟾蜍仰卧固定，用止血钳牵拉，使口腔张开，于上腭粘膜处滴加药液0.5mL，使药液完全浸没上腭，接触30min后，用生理盐水洗净药物，分离蟾蜍两眼之间的粘膜，面积为3mm×3mm，用生理盐水洗净血块及杂物，粘膜面向上，平铺于载玻片上，于粘膜表面滴加生理盐水0.2mL，盖上盖玻片，于10×45倍光学显微镜下观察纤毛运动情况，随后置于加有少量蒸馏水的密闭容器中，密闭，使水蒸气近饱和状态，环境温度保持在20～25℃。每隔适当时间取出，显微镜观察，直到纤毛停止运动。记录从开始给药到纤毛完全停止运动所需要的时间。另取蟾蜍如上操作，滴加生理盐水(Physiological saline)0.5mL作为阴性对照。以公认的具有纤毛毒性的1%去氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)作为阳性对照，考察6种不同脱乙酰度的壳聚糖溶液(Chitosan solution)的鼻腔毒性。以给药组蟾蜍的纤毛持续运动时间除以生理盐水组蟾蜍的纤毛持续运动时间，得到纤毛持续运动时间相对百分率。相对百分率越高，药物的纤毛毒性越小。

2.2 壳聚糖对大鼠鼻腔粘膜形态学的影响 健康SD大鼠，雌性，分为9组，每组3只。大鼠用乙醚轻微麻醉后，分别鼻腔给予生理盐水、1%去氧胆酸钠、6种不同脱乙酰度的0.25%壳聚糖溶液、1%冰醋酸。每100g体重给予0.1mL，每日3次，连续7 d，第8天股动脉放血处死大鼠，立即取鼻中隔粘膜，用定量生理盐水冲洗。取下粘膜置中性甲醛液中，固定，经脱水处理后，石蜡包埋，切片3～5μm，苏木精－伊红染色，在光学显微镜下观察鼻粘膜组织结构的改变。

3 结果

3.1 壳聚糖对蟾蜍上腭纤毛运动时间的影响［4］壳聚糖对纤毛运动时间的影响见表1。作为阳性对照的1%去氧胆酸钠在30min内使纤毛运动停止。各种脱乙酰度的壳聚糖对纤毛的摆动时间影响不同。2、3、4、6号基本无影响，1号和5号未发现纤毛运动，估计原因为蟾蜍放置时间过久(由大鼠鼻腔切片可进一步证明所有壳聚糖都无毒性)。由表1可以得出结论:0.25%壳聚糖溶液对纤毛摆动时间基本没有影响。

表1 壳聚糖对在体蟾蜍纤毛运动时间的影响

蟾蜍上腭粘膜给0.25%壳聚糖溶液后显微镜下观察的结果见图1。在显微镜下，可直观的观察到蟾蜍上腭黏膜纤毛的摆动，尤其在黏膜的边缘更加清晰，如图1箭头所示。

图1 蟾蜍上腭粘膜给0.25%壳聚糖后显微镜下结果(×400)

3.2 壳聚糖对大鼠鼻腔粘膜形态学的影响［5］根据药物对鼻腔粘膜的刺激作用，将药物对鼻腔粘膜的刺激作用分为3个级别:轻度、中度和重度。评判标准如下:

轻度:粘膜上皮细胞完整，粘膜下少量炎细胞浸润。

中度:粘膜上皮细胞水肿，粘膜下炎细胞浸润。

重度:粘膜上皮细胞变性坏死，大量炎细胞浸润。

经本次实验验证，去氧胆酸钠组为重度刺激，生理盐水组、1%冰醋酸组、6种脱乙酰度的0.25%壳聚糖组为轻度刺激。说明0.25%壳聚糖对大鼠鼻腔粘膜无黏膜毒性，结果见图2。

图2 大鼠鼻粘膜切片图(×100)

4 讨论

研究药物鼻腔纤毛毒性的动物模型有鸡胚气管的粘膜纤毛和蟾蜍上腭粘膜纤毛，后者与哺乳动物鼻粘膜纤毛在组织上相似，且材料易得，操作简便，故应用较广。本次实验以在体蟾蜍上腭为模型，观察了壳聚糖对纤毛运动的影响。实验结果证明:脱乙酰度为 82.8%、85.4%、88.5%、91.1%、92.1%、95.4%的0.25%壳聚糖溶液对纤毛毒性很小或可看做无纤毛毒性。此外，蟾蜍体重大小、给药量的多少、所取粘膜的位置及标本制作时间是影响在体蟾蜍上腭模型法测定结果准确性及重复性的主要因素。如本次实验由于动物房提供蟾蜍不是很方便，一次买来的10只蟾蜍在每天做2只的情况下最后2只纤毛未发现运动，估计原因是在不适合蟾蜍生存的实验室环境放置过久。另外在实验中发现，即使在饱和水蒸气的密闭容器中放置切片，仍需要不定时的在盖玻片边缘滴加少量生理盐水，因为切片要经常的取出在显微镜下观看，观看时水分的蒸发会导致切片失去水分，因失水导致纤毛提前停止运动会影响最后的实验数据。在装片前应将蟾蜍上腭表皮外的一层粘稠物质除去，装片应使粘膜外层朝上，否则不易观察。

鼻粘膜毒性最直观的评价方法是用显微镜观察给药后粘膜细胞组织结构的变化及表面纤毛的形态变化。壳聚糖对大鼠鼻腔粘膜形态学影响的实验证明:脱乙酰度为82.8%、85.4%、88.5%、91.1%、92.1%、95.4% 的 0.25% 壳聚糖对大鼠鼻粘膜无毒性。

本实验结果证明:不同脱乙酰度的壳聚糖溶液均无鼻腔毒性，因此壳聚糖可作为鼻腔给药的辅料，在鼻腔给药系统中广泛应用。

［1］陈新梅.用于全身治疗的鼻腔给药系统研究概况［J］.中国现代应用药学，2007，24(1):23 －27.

［2］陈新梅.生物粘附性粉末在鼻腔给药中的应用新进展［J］.中国药业，2009，18(17):76 －77.

［3］陈新梅，李心沁.壳聚糖载体对药物鼻腔吸收的促进作用［J］.中国临床药理学与治疗学，2008，13(9):981－984.

［4］王优，高永良.G－2407－3鼻腔喷雾剂及其辅料对鼻黏膜纤毛运动的影响［J］.解放军药学学报，2010，26(1):7－9.

［5］杨艳伟，林志，李珊珊，等.大、小鼠鼻腔毒性病理检查标本制片方法的探讨［J］，中国新药杂志，2009，18(7):646－648.