牛磺酸对急性染锰大鼠空间学习记忆能力的改善作用

陆彩玲，吴元桢，唐付华，刘楠楠，黄 玲，郭松超

(广西医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，广西南宁 530021)

锰是生物必需的微量元素之一，参与各种重要的生理过程，包括蛋白质、脂质及碳水化合物等大分子的代谢，机体正常的免疫功能，与细胞ATP结合调节细胞能量代谢，维持正常的骨骼生长及连接组织功能。然而，短期高浓度职业锰暴露或生活环境长期低浓度锰暴露易诱发神经精神异常，包括记忆损伤、学习能力下降及易怒、冲动、焦虑、强迫行为和幻觉等［1］。近期人群流行病学调查［2］及动物实验［3］研究表明，长期锰暴露导致人或受试动物学习记忆能力受损。迄今为止关于锰暴露与运动或行为异常间的关系已有临床观察和动物研究报道，但锰暴露对认知能力的影响及其发生机制报道甚少。学习记忆是复杂的过程，海马与学习记忆密切相关，而乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)则是介导学习记忆的重要神经递质，因此，本研究拟建立急性染锰的动物模型后并给予牛磺酸干预，通过水迷宫实验观察大鼠的空间学习能力、空间记忆能力的改变，测定海马组织乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase，AChE)及胆碱O-乙酰转移酶(choline O-acetyltransferase，ChAT)活力以指示ACh含量，探讨锰诱导大鼠空间学习记忆损伤的分子机制及牛磺酸对锰中毒的干预作用。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

MnCl2·4H2O和牛磺酸(Sigma公司)。Morris水迷宫系统，UV-1700紫外可见分光光度计(日本岛津);721分光光度计，Hettich台式高速冷冻离心机和微量电动组织匀浆机(瑞士Kimble公司)。BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012)(碧云天生物技术研究所);AChE测试盒，批号为20100612，和ChAT测试盒，批号为20100612(南京建成生物工程研究所)。

1.2 动物、实验分组及给药

SPF雄性SD大鼠，体质量160～200 g，广西医科大学实验动物中心提供，动物许可证号:SCXK桂2009-0002，习惯性喂饲1周后随机进入牛磺酸预防实验和牛磺酸治疗实验。

1.2.1 牛磺酸预防实验

60只大鼠分为正常对照组，染锰对照组和染锰+牛磺酸预防组。正常对照组连续ip给予0.9%生理盐水4周，染锰对照组连续ip给予MnCl2·4H2O 15 mg·kg－1溶液，连续染毒4周，牛磺酸预防组则染锰的同时ip给予牛磺酸200 mg·kg－1，持续4周。

1.2.2 牛磺酸治疗实验

40只大鼠分为染锰对照组及染锰+牛磺酸治疗组。所有大鼠均ip给予MnCl2·4H2O 4周后，染锰对照组改为ip给予生理盐水4周，而染锰+牛磺酸治疗组则改为ip给予牛磺酸200 mg·kg－14周，共8周。

1.3 水迷宫实验

动物干预结束后进行水迷宫实验测定学习记忆能力变化。水迷宫系统由一个直径为1.5 m的黑色不锈钢水池，隐藏在水下2 cm的平台，水池上方的图像采集系统和水槽外的处理系统组成。将大鼠面向池壁分别自Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ4个象限放入水池，摄像系统摄取大鼠90 s内在圆池内游泳找到隐藏在水下2 cm平台的时间、路程及速度等参数，每天4次，连续5 d。以大鼠潜伏逃避时间作为评价。6 d则撤除平台，自任一象限内将大鼠投入水池，观察动物90 s内通过原平台的次数(平台搜索次数)进一步评价大鼠的空间记忆能力。水迷宫周围摆放物品及大鼠各象限入水点实验期间固定不变。

1.4 AChE 活力测定

去除双侧大脑皮质，取左、右两侧半月形海马，称重后按试剂盒要求加入9倍体积的生理盐水制成10%的组织匀浆，1164×g离心10 min后取上清40 μl按试剂操作程序测定AChE活力，同时用BCA法定量海马组织匀浆中蛋白含量。

1.5 ChAT 活力测定

将上述10%海马组织匀浆稀释至5%，测定ChAT活力。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 牛磺酸对染锰大鼠逃避潜伏期及平台搜索次数的影响

2.1.1 预防性给予牛磺酸

由表1可知，与正常对照组比较，急性染锰大鼠潜伏逃避时间显著延长(P＜0.05)，搜到目标区域稍有减少，但并不明显。染锰同时给予牛磺酸预防大鼠的潜伏逃避时间恢复至正常水平。锰染毒及预防性给予牛磺酸对搜索目标区域的有效次数无影响，与正常对照组相比无统计学差异。

表1 预防性给予牛磺酸对染锰大鼠水迷宫逃避潜伏期及平台搜索次数的影响Tab.1 Effect of taurine pretreatment on escape latency and probe times in rats exposed to manganese chloride

2.1.2 治疗性给予牛磺酸

由表2可知，大鼠染锰后给予治疗牛磺酸后潜伏逃避时间较染锰对照组明显缩短(P＜0.05)，搜到目标区的有效次数与治疗对照组相比并无统计学差异。

表2 治疗性给予牛磺酸对染锰大鼠水迷宫逃避潜伏期及平台搜索次数的影响Tab.2 Effect of taurine treatment on escape latency and probe times in rats exposed to manganese chloride

2.2 牛磺酸对染锰大鼠海马组织乙酰胆碱酯酶及胆碱O-乙酰转移酶活力的影响

2.2.1 预防性给予牛磺酸

由表3可知，与正常对照组相比，染锰稍稍降低海马组织AChE及ChAT活力，但并无统计学差异。同时给予牛磺酸预防可以明显下调海马组织中AChE活力(P＜0.05)，但对 ChAT活力影响也不明显。

2.2.2 治疗性给予牛磺酸

表4结果表明，染锰后予以牛磺酸治疗，牛磺酸均能显著提高AChE及ChAT活力(P＜0.05)。

表3 预防性给予牛磺酸对染锰大鼠海马组织乙酰胆碱酯酶(AChE)及胆碱O-乙酰转移酶(ChAT)活力的影响Tab.3 Effect of taurine pretreatment on acetylcholine esterase(AChE)and choline O-acetyltransferase(ChAT)activities in hippocampus of rats exposed to manganese chloride

表4 治疗性给予牛磺酸对染锰大鼠海马组织AChE及ChAT活力的影响Tab.4 Effect of taurine treatment on AChE and ChAT activities in hippocampus of rats exposed to manganese chloride

3 讨论

本研究发现急性染锰后大鼠学习能力出现显著下降，记忆能力也略有降低。并且锰暴露后即便脱离染毒环境如不予以有效干预学习记忆能力依然不能自主恢复而改变锰的既定毒效，且有可能较脱离初期更严重，这可能与锰不断累积于脑组织且一旦进入难以清除有关。随着对学习记忆研究的深入，认为该生理过程涉及大脑高级神经中枢特定的解剖部位、神经环路及神经递质。大鼠空间航行记忆能力依赖于海马结构并与胆碱能神经递质相关［4］。ACh冲动传入与运动、认知、情绪及行为密切相关，AChE和ChAT分别是分解和合成介导学习记忆重要的神经递质—ACh的两个重要酶。本研究发现，急性染锰后海马AChE活力稍有降低，与国外有关急性染锰后AChE升高的报道［5］相反，该差异可能与锰暴露动物的年龄、暴露途径、染锰剂量和染锰时间长短以及检测的脑区不同都有关［6－8］。本研究中急性染锰轻微抑制海马ChAT活力，与国外研究认为长期染锰可能仅导致纹状体的ChAT活力显著降低，其他脑区并无明显变化一致［9］。总之，急性锰暴露导致大鼠空间学习记忆障碍极其复杂，除胆碱能系统外，可能尚有其他机制或者其他脑区的胆碱能系统参与锰对大鼠学习记忆的损伤，如有报道Mn2+也可以作为N-甲基-D-天门冬氨酸受体通道抑制剂而导致学习记忆损伤［10］。

牛磺酸是一种具有多种生理功能并能在中枢神经系统中发挥重要作用的一种化合物［11－12］。临床上牛磺酸已广泛用于老年痴呆和老年神经异常等多种疾病的治疗。而有研究认为，牛磺酸本身对学习记忆并无改善作用，但能有效地对抗各种诱导学习记忆障碍的化合物如戊巴比妥钠和亚硝酸钠等物质导致的学习记忆能力损伤［13］。本研究也发现牛磺酸能改善锰诱导的空间学习能力下降，这可能部分与牛磺酸对胆碱能神经系统的疗效有关。但牛磺酸预防和治疗对乙酰胆碱系统改变可能存在时程差异，即牛磺酸预防性给予时主要显示下调AChE活力，减少ACh分解，而锰暴露后牛磺酸的治疗性给予则上调ChAT活力增加ACh合成，最终达到提高体内ACh含量，增强神经突触的兴奋从而改善学习记忆能力。但牛磺酸对锰诱导学空间习记忆能力损伤的改善机制，对ACh系统影响的时间差异都有待进一步研究。

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