5－羟色胺转运体基因多态性与脑卒中后抑郁的关系

曹金霞 耿德勤 姜建东 刘 莉 姜玉龙 孙德锦

1）江苏连云港第二人民医院神经内科 连云港 222002 2）徐州医学院附属医院神经内科 徐州 221002

脑卒中后抑郁症（post－stroke depression，PSD）是脑卒中最常见的并发症之一，分析显示占脑卒中患者30%左右，常直接影响患者的生活质量和神经功能康复［1－2］。PSD的发生与中枢5－HT能系统功能障碍关系密切，位于突触前膜的5－HT转运体（5－HTT）通过再摄取突触间隙的5－HT而在5－HT代谢及功能精细调节中起关键作用，其编码基因SCL6A4是抑郁症分子遗传研究的焦点［3－6］。现在已知的众多5－HTT基因多态性中，绝大多数多态性对5－HTT基因的结构和功能表达没有影响，5－HTT基因5’端启动子区域上的5－HTTLPR多态性，是一个44个碱基的插入／缺失多态性，是5－HTT基因转录调控的主要位点［7］，5－HTTLPR多态性和抑郁症的关系已被国内外大量研究证实［6］，国外有研究显示5－HTTLPR多态性与PSD关联［3－5］，但是目前国内有关于PSD与5－HTT基因多态性的研究非常少［9－10］，如果能找到5－HTT基因多态性和PSD有很好的相关性，那么就可以指导临床。本研究采用病例－对照研究及关联分析的方法，在江苏汉族人群中探讨5－HTTLPR多态性与PSD的关系，寻找PSD发病的遗传易患因素。

1 对象与方法

1.1 对象 系2006－01～2011－06在徐州医学院附属医院和连云港市第二人民医院神经科住院汉族首次发病的脑卒中患者387例，均符合全国第4届脑血管病学术会议修订的诊断标准，并经头颅CT或MRI确诊。入组者均无意识障碍及智能障碍，既往无精神病史。其中符合中国精神障碍分类与诊断标准第3版（CCMD－3）“抑郁症”诊断标准及入院后第2周、第4周汉密尔顿抑郁量表（HAMD）17项评分＞17分，并持续2周以上者96例归入PSD组，男39例，女57例；年龄39～70岁，平均（56.9±7.9）岁；脑梗死79例，脑出血17例。291例非PSD患者中随机选择97例归入非PSD对照组，男43例，女54例；年龄40～65岁，平均（55.2±6.0）岁；脑梗死77例，脑出血20例。同时选择徐州医学院附属医院体检中心健康体检者共60例作为正常对照组，男24例，女36例；年龄40～65岁，平均（46.7±5.5）岁。对照组性别、年龄与PSD组相匹配。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取：抽取入组者外周静脉血5mL，EDTA抗凝，采用常规方法提取DNA（根据TIAN－GEN生化科技（上海）有限公司提供的DNA提取试剂盒说明进行）。

1.2.2 5－HTTLPR多态性检测：采用聚合酶链反应技术，引物设计通过引物设计软件primer 5.0及参考文献进行，将通过软件设计得到的多对引物输入到美国国立图书馆数据库的BLAST中（网址：www.ncbi.nlm.nih.gov／blast）进行引物的同源性比较，选出同源性最小而退火温度（Tm值）合适的引物确定为PCR反应引物，通过大连宝生物有限公司合成。上游引物为5′－GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC－3′，下游引物为5′－GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC－3′。PCR反应体系25μL，dNTPs 200μmol／L，上、下游引物各10pmol／μL，10倍GC缓冲液8μL，TaqDNA聚合酶1U，模板DNA 100ng。反应在PCR扩增仪PT－100型进行。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，64℃退火45s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃延伸5min。产物检测用2%琼脂糖凝胶，80V电压电泳60min，溴酚蓝染色后用凝胶成像仪照相观察电泳带型确定基因型。目的基因的片段长度：S：484bp，L：528bp。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件包建立数据库并进行统计分析。计量资料用均数±标准差（）表示，2组间比较用独立样本t检验或Mann－Whitney U检验，多组间比较用方差分析或非参数检验；计数资料用频数或百分位数表示，吻合度χ2检验用于检验各组是否符合Hardy－Weinberg（H－W）平衡法则；χ2检验用于比较各组间基因型和等位基因频率的分布，等位基因与PSD的关系采用比值比（OR）估计相对危险度。

2 结果

2.1 基因型 本研究检测到5－HTTLPR基因多态性的2种等位基因（见图1）：S等位基因（484bp）、L等位基因（528 bp），3种基因型：SS、LS和LL型。未见到文献中曾报道的超长L等位基因（572bp或616bp）。

2.2 Hardy－Weinberg遗传平衡吻合度检验（H－W 平衡）各组基因型均满足 H－W 平衡（PSD组：χ2＝1.46，P＝0.22；非PSD组：χ2＝0.65，P＝0.42；正常对照组：χ2＝0.93，P＝0.34），表明本实验所测基因型数据可靠，能代表各群体水平。

2.3 各组5－HTTLPR基因型和等位基因频率比较 见表1。数据分析结果显示PSD组和脑卒中后非PSD组以及健康对照组间5－HTTLPR基因型频率（SS、SL、LL）有显著差异（χ2＝10.05，P＝0.04），PSD组SS基因型频率（54.2%）及S等位基因频率（71.9%）显著高于脑卒中非PSD组（37.1%，59.3%）和健康对照组（33.1%，55.0%），携带 S等位基因者PSD的危险较对照组提高了1.76倍（OR＝1.76，P＜0.01，95%CI：1.15～2.69）。

图15 －HTTLPR多态位点PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

表1 各组5－HTTLPR基因型及等位基因频率的比较 ［例（%）］

3 讨论

脑卒中后抑郁（post stroke depression，PSD）的发病机制复杂，近几十年研究并未得出肯定性的结论［1－2］。有研究［1，8］发现抑郁病史及抑郁症家族史是PSD发生主要预测因素之一，提示PSD存在遗传易感性，寻找PSD的易感基因成为研究的一个重点［3－5］。5－羟色胺重摄取抑制剂（SSRIs）有效治疗PSD，提示PSD也与脑内的5－HT代谢失衡有关。5－HT转运体（5－HTT）是SSRIs类药物作用靶点，也是5－HT代谢的关键环节，5－HTT功能受5－HTT基因转录调控，5－HTT基因也是PSD遗传学研究的焦点。5－HTT基因5’端启动子区域上的5－HTTLPR多态性，是5－HTT基因转录调控的主要位点［7］，在基因表达水平上影响5－HTT的转运功能，因而有理由认为5－HTTLPR多态性和PSD可能存在相关性。

本研究结果显示PSD组5－HTT基因的5－HTTLPR多态性SS基因型频率及S等位基因频率显著高于脑卒中非PSD组和健康对照组，携带S等位基因者PSD的危险性提高了1.76倍（OR＝1.76，P＜0.01）。提示5－HTTLPR多态性可能与中国汉族PSD的发病存在一定相关性，SS基因型及S等位基因是中国汉族PSD的危险因子。欧美人群［3－5］和国内［9］研究也提示5－HTTLPR多态性与PSD的发病相关，支持本实验结果。

根据启动子区5－HTTLPR多态性将5－HTT基因分为L／L、L／S、S／S3个基因型。在蛋白产物水平上，LL基因型产物的重摄取5－HT能力分别是LS基因型产物、SS基因型产物的1.9倍和2.2倍，“L”等位基因能增强5－HTT基因的转录和5－HTT蛋白的表达，从而使5－HT的回吸收率升高，因而认为“L”与“S”在5－HTT基因的转录和转运体蛋白的表达上有不同的功能，从而影响5－HT的生理功能［7］。但5－HTTLPR究竟具体是通过何种途径来影响5－HTT功能，目前还不清楚，尚需进一步的研究。尽管结论尚不一致，大量研究支持S型等位基因与应激事件后发生抑郁风险相关，SS基因型与应激事件相互作用导致抑郁的发生［6］。

本研究初步探索5－HTTLPR多态性与PSD的关系，为以后继续进一步研究奠定了基础。尽管本次研究发现5－HTTLPR多态性与中国汉族PSD之间可能存在一定关联，但本研究仅涉及多个多态位点中重要的一个，其他位点以及各位点间的相互作用对PSD的影响尚未研究。本研究的样本量较少，并且缺乏家系资料，未能进行传递平衡检验，因此更需要在相同或不同人种和地理环境背景下的其他或更大的独立患者样本及家系中进行谨慎的重复性试验来验证5－HTTLPR多态性与PSD的关系。

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