香蕉乙二醛酶基因MaGLO14的克隆及在非生物胁迫下的功能鉴定*

刘菊华，邓成菊，3，金志强，2，谢学立,贾彩红，张建斌，徐碧玉

(1.中国热带农业科学院热带生物技术研究所∥农业部热带生物技术重点开放实验室,海南 海口 571101；2. 中国热带农业科学院海口试验站∥香蕉研究所,海南 海口 570102；3. 云南省红河热带农业科学研究所,云南 红河 661300)

甲基乙二醛(Methylglyoxal,MG)是一种细胞毒素的代谢物，MG产生于糖酵解、氨基酸分解代谢、丙酮的正常代谢和环境逆境胁迫，在微生物，酵母，动物以及高等植物中都存在[1]。甲基乙二醛及其他包括乙二醛等在内的α羰基醛类可在体内通过糖化作用与蛋白质、核酸形成共价化合物，生成果糖胺和高度糖化终产物(advancedglycation end products，AGE)，产生细胞毒性。

乙二醛酶(glyoxalase,GLO)途径包括两个酶，即乙二醛酶I(GLO I)和乙二醛酶II(GLOII)，是一种胞内酶，普遍存在于各种细胞器中，尤其是线粒体中，它的活性贯穿整个生命的始终。生物体内对甲基乙二醛的代谢主要是在GLO I的作用下将MG和谷胱甘肽(glutathione,GSH)缩合生成S-D-乳酸谷胱甘肽,降低MG的生理活性浓度，接着在GLOII的作用下将S-D-乳酸谷胱甘肽水解成无毒的GSH和D-乳酸[2]。

目前，在很多植物中分离到乙二醛酶I，如大豆[3]、苋菜[4]、小麦[5]、水稻[6]等。乙二醛酶基因的克隆及功能研究也有了相关报道， Bhomkar 等[7]用35 S启动子启动乙二醛酶I基因在烟草中过量表达能增强植株叶片抗衰老的能力，用夜香树黄叶卷曲病毒(Cestrum yellow leaf curling virus ，CmYLCV)启动子启动乙二醛酶基因在豇豆中过量表达也能增强转基因植物的抗盐性。Lin 等[5]用禾谷镰刀菌侵染麦穗诱导了小麦乙二醛酶I基因的表达，同时也受高浓度的NaCl和ZnCl2的诱导。将小麦乙二醛酶基因转化烟草，转基因烟草对100 mmol/L的NaCl和20 mmol/L的ZnCl2具有高度忍耐性。Roy 等[8]在拟南芥中用盐诱导启动子(rd29A)过量表达芥菜乙二醛酶I基因，转基因拟南芥能在150 mmol/L的NaCl胁迫下正常存活。Singla-Pareek 等[6]研究指出在水稻中过量表达水稻乙二醛酶II基因，转基因水稻乙二醛酶II的活性维持在一个很高的水平，并表现出对盐和MG胁迫的忍耐性，且在盐胁迫下表现出持续生长和维持良好的离子平衡。但总体从植物中克隆的乙二醛酶基因数量较少，除了耐盐性以外，其它功能了解甚少。

香蕉是重要的热带水果之一，是喜高温，怕低温的作物，温度和水分是香蕉分布的主要限制因子。温度首先影响香蕉的生长速度，当气温低于15 ℃时，香蕉的生长会受到很大的影响，当气温低于10 ℃时，生长就会受到抑制。香蕉无主根，而且是肉质根，叶面积大，生长期对水的需求量也大，但是香蕉的根系生长与活动需要充足的氧气，这决定了香蕉喜湿热气候，在土层深、土质疏松、肥沃、排水良好的地里生长比较旺盛。然而，由于全球异常气候的增多，香蕉处于高温、低温、干旱、盐碱、风害等逆境的时间也增多，这严重影响了香蕉产量并制约着香蕉产业的发展。

本实验室采用抑制缩减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)方法分离了在香蕉采后成熟早期差异表达的低丰度cDNA序列，获得289个重组克隆[9]。NCBI BlastX 结果显示,其中有一个496 bp的片段与其他物种的GLO基因序列相似。本研究通过RACE技术，获得了MaGLO14全长，通过对该基因在不同逆境处理下的表达分析及转化烟草研究其与香蕉非生物胁迫的关系及可能的功能。

1 材料和方法

1.1 材料

香蕉根、茎、叶、花、果实均来自中国热带农业科学院热带生物技术研究所香蕉种植园。将采收的根、球茎、叶、花用无菌水清洗并用w=1‰的次氯酸钠表面消毒，立即在液氮中冷冻。将采收的香蕉果实立即切割成单果指，用无菌水清洗并用w=1‰的次氯酸钠表面消毒，放入22 ℃恒温箱正常成熟。当天处理的果实即为采后0 d，隔2 d取材，将样品切割成块立即用液氮冷冻，放入-70 ℃冰箱中保存，以备RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 香蕉根、茎、叶、花、果实RNA的提取和cDNA第一链的合成 按照Wan和Wilkins[10]的方法，从香蕉根、茎、叶、花和采后不同时间的果实中提取总RNA。每个样品取4 μg RNA，利用Invitrogen SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase 合成cDNA第一链。

1.2.2MaGLO14 c DNA克隆 根据SSH文库所获得的该基因的片段设计了5′-RACE引物(5′AAGAAGCTCCATACCAAATGC 3′)和3′-RACE引物(5′ATAGCGATGATGGGATACGGT 3′)， RACE PCR反应程序为：94 ℃预变性1 min; 94 ℃变性5 s,68 ℃退火10 s,循环35次；72 ℃延伸13 min。

参照美国Clontech公司的SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit 试剂盒说明书，以香蕉采后正常成熟2 d的RNA反转录的cDNA第一链为模板，利用RACE技术克隆MaGLO14 cDNA的5′和3′端。PCR产物经w=1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收该片段,连接到pMD18-T载体，热激转化大肠杆菌DH5α，挑单菌进行PCR鉴定。将鉴定的阳性克隆测序，通过序列比对和拼接得到基因全长cDNA序列。

再根据拼接序列设计5′引物(5′TACGCCATGGGACGAGGTCGAAGACAGGA 3′)和3′引物(5′ ATGTACTAGTGATAACAAGGGCGGAATAC 3′)，以香蕉果实正常成熟2 d的cDNA第一链为模板，克隆MaGLO14的全长cDNA。

1.2.3MaGLO14在香蕉不同器官的表达分析 以香蕉根、茎、叶、花和果实采后2 d的 cDNA为模板，采用RT-PCR方法对其进行器官特异性表达分析。

MaGlO14的RT-PCR引物为5′引物(5′GGAAAGGTCCATCAAGTT3′)和3′引物(5′ACAGGGCAATCTCAGGTA3′)。内参Actin选用NCBI上已登录的香蕉Actin基因(基因登陆号：EF672732)，引物为P1(5′-CGAGGCTCAATCAAAGA-3′)和P2(5′-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3′)。RT-PCR的反应程序如下：95 ℃预变性3 min; 95 ℃变性15 s,56 ℃退火15 s,72 ℃延伸20 s,循环30次；72 ℃延伸10 min。

1.2.4 RT-PCR检测MaGLO14在香蕉非生物胁迫下的表达 将五叶一心的香蕉幼苗进行干旱[11]、盐胁迫[12]、低温[13]、涝害胁迫(将香蕉幼苗根部全部浸入水中，淹水处理6,12,24,36 h,定期取直径为1 mm左右白色新嫩根，迅速吸干根表面水分，立即液氮速冻，置于-70 ℃冰箱保存备用。以淹水处理0 h的样品为对照。)和乙烯利(用φ=40 %的乙烯利稀释200倍喷洒香蕉幼苗，直到叶尖滴下液滴为止，按照6、12和24 h取样，切成小块置于液氮中速冻，保存于-70 ℃。)等不同的非生物胁迫处理，提取不同处理条件下不同处理阶段的幼苗叶片或根的RNA，反转录成cDNA第一链后作为模板。所用的MaGLO14引物和内参Actin1引物、RT-PCR反应程序同1.2.3。

1.2.5MaGLO14转化烟草及鉴定 以pCAMBIA1304载体为基础，将不包含终止密码子的MaGLO14的cDNA片段插入到35 S启动子的下游，GFP基因的上游，使MaGLO14与GFP形成融合蛋白，由35 S启动子启动表达。命名为pCAMaGLO14。烟草转化参考Singla-Pareek方法。以植物表达载体pCAMaGLO14中的MaGLO14基因序列设计5′端引物，绿色荧光蛋白基因上设计3′端引物，进行转化植株的PCR检测，引物的扩增片段大小为1 047 bp。在PCR检测阳性植株中随机挑选6株，提取其基因组DNA，用EcoRI对其进行酶切，标记MaGLO14接近3′端一段cDNA序列作为探针， 进行Southern blot分析。

挑选Southern blot信号最强的编号5号的转基因烟草，参照Singla-Pareek(2007)方法进行体外叶片耐盐实验。

2 结果和分析

2.1 MaGLO14cDNA克隆与生物信息学分析

根据RACE扩增结果拼接获得全长1 286 bp 的序列，通过ORF Finder和GENACAN 软件分析表明该cDNA序列有一个翻译起始密码子ATG,相同读码框内有一个终止密码子TGA,表明此序列具有一个完整的ORF，编码358个氨基酸。随后，设计2条引物，从正常成熟2 d的RNA反转录的cDNA第一链模板中克隆到1 195 bp的基因全长。

BlastX分析表明，MaGLO14基因属于乙二醛酶I类基因，其推导的氨基酸序列与云杉(ABK22263)、葡萄(CBI23235)、葡萄柚(CAB09799)、棉花(ACJ11750)和蓖麻(EEF43857)有较高的一致性，分别为82%、83%、82%、80%、82%(图1)。

图1 不同植物的MaGLO14基因推导的氨基酸序列比较

分子进化树分析表明，MaGLO14cDNA推导的氨基酸序列与云杉的进化关系最近，与芸苔、葡萄柚、毛果杨、葡萄、棉花的进化关系次之，与苜蓿、拟南芥、蓖麻的进化关系最远(图2)。

图2 MaGLO14的分子进化树分析

2.2 MaGLO14 器官特异性表达分析

从图3可知，MaGLO14基因在香蕉根、茎、叶、花、果实中均有表达。是一个组成型表达的基因，推测该基因可能在香蕉的不同器官中发挥作用。

图3 MaGLO14的器官特异性表达分析

2.3 RT-PCR检测MaGLO14在不同非生物胁迫处理下的表达

图4表明,MaGLO14 在干旱胁迫诱导条件下呈现下调表达，表达水平与干旱处理的时间没有明显的相关性； 300 mmol/L的NaCl胁迫下，处理2 h，MaGLO14表达略有降低，处理4h时该基因表达达到一个峰值，随后又下降；温度从常温降低到10 ℃，MaGLO14的表达没有明显的差异，但随着温度的进一步降低到7 ℃、5 ℃，基因的表达水平明显上升达到较高水平；在涝害(即缺氧)胁迫下，基因呈现下调表达；乙烯利处理香蕉幼苗，处理后6 h,基因表达增强，处理12 h后表达达到峰值，处理24 h后基因表达略有下降，但还保持在较高水平。

图4 MaGLO14在不同非生物胁迫下的表达分析

2.4 转MaGLO14 烟草分子检测及耐盐鉴定

PCR检测共获得36株阳性烟草植株。随机挑选6株进行southern blot 鉴定，结果显示2、4、5、6株系检测到了杂交信号，表明MaGLO14已整合到这4个植株的基因组中(图5)。用去离子水作为对照与400 mmol/L和800 mmol/L的NaCl溶液分别处理野生型烟草和编号为5的转基因烟草离体叶片，结果显示用400 mmol/L和800 mmol/L的NaCl的溶液处理烟草叶片，处理2 d转基因植株的叶片受伤害的程度明显比野生型轻，800 mmol/L的NaCl的溶液处理的野生型烟草叶片有轻微失绿和明显褐化斑点，受伤害程度最重。处理3 d，野生型烟草叶片呈现失绿和严重褐化，而转基因的烟草叶片只是因为渗透失水而表现为叶盘上卷，并没有表现明显的组织坏死(图6 a)。RT-PCR检测400 mmol/L和800 mmol/L的NaCl溶液处理烟草叶片MaGLO14表达，转基因烟草基因表达量明显增强(图6 b)。

同时测定其叶绿素的含量，转基因烟草和野生型烟草用不同浓度的NaCl溶液处理离体叶片2或3 d，转基因烟草叶绿素含量明显比野生型烟草叶绿素含量高(图7)。

图5 转MaGLO14的烟草植株的Southern blot分析

图6 转MaGLO14的烟草植株叶片的耐盐性分析

图7 转MaGLO14的烟草和野生型植株叶片的叶绿素质量浓度分析

3 讨 论

根据生物信息学分析结果，本研究所分离得到的MaGLO14基因在分子进化上与云杉具有较亲的关系，其推导的氨基酸序列与芸杉、芸苔、葡萄、葡萄柚、棉花等都具有较高的相似性。采用PredictProtein软件分析发现该基因存在GlyoxalaseI的极为保守结构域，此外还具有3个酪氨酸激酶磷酸化位点、4个酪氨酸激酶II磷酸化位点、1个糖基化位点、2个蛋白激酶C的磷酸化位点和4个豆蔻酰化位点[14]。这些功能性位点的存在是MaGLO14基因行使其正常的生理功能所必需的。

植物乙二醛酶基因的功能研究主要集中在耐盐方面。Espartero 等研究了编码番茄的一个乙二醛酶I基因GLX1，用NaCl胁迫处理番茄植株，根、茎、叶中该基因在mRNA和氨基酸水平上提高了两到三倍[15]。Lin等用100 mmol/L的NaCl处理小麦幼苗，乙二醛酶基因表达比用水处理表达量约高两倍。在转基因方面也证实该基因具有增强植物耐盐性[5]。植物在胁迫条件下保持叶绿素含量的能力可以作为植物受到伤害的一个指标。Singla-Pareek等在烟草中过量表达芥菜乙二醛酶II基因，转基因烟草比野生型烟草具有更强的耐盐能力，用400 mmol/L和800 mmol/L的NaCl处理离体叶片，野生型烟草比转基因烟草叶绿素降解更快[6]。Bhomkar等在豇豆中过量表达芥菜乙二醛酶I基因，用NaCl (400与600 mmol/L) 处理离体豇豆叶片转基因豇豆叶片衰老比野生型豇豆衰老慢，叶绿素降解也比野生型慢[7]。我们转MaGLO14烟草在氯化钠处理下基因上调表达，转基因烟草离体叶片氯化钠处理结果也显示比野生型烟草具有更高的忍耐性，转基因烟草盐胁迫下比野生型烟草叶片含有更高的叶绿素。说明香蕉的MaGLO14过量表达以后确实可以提高植物的耐盐性，这与前人的研究结果是一致的。

在本研究中该基因在低温、乙烯利胁迫下上调表达，而在干旱、水分胁迫下下调表达。这些表达特性显示在以上相关的胁迫过程中，MaGLO14都具有重要的作用。而这些特性在其他植物乙二醛酶I的研究中尚未见报道，我们推测这可能和乙二醛酶I作用底物的非专一性有关，如甲基乙二醛、羟基丙酮醛、磷酸化羟基丙酮醛、乙二醛、苯甲酰乙二醛和许多其他的带有烷基和芳香基团的醛类都是它的底物[2]，具体机理还有待进一步研究。

为了进一步验证香蕉MaGLO14在非生物胁迫下的功能，我们通过将其转化到酵母中进行了验证，在盐胁迫、水分胁迫、干旱胁迫、低温胁迫和紫外胁迫下都增强了酵母的存活率[16]。这些研究将对进一步利用该基因进行抗性育种具有重要意义。

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