大黄酚对铅中毒小鼠学习记忆的改善作用及其机制研究

张 季，严春临，张丹参，张 力，王 树

(河北北方学院基础医学院药理学教研室，河北张家口 075000)

大黄酚(Chrysophanol，Chry)是大黄(rhubarb)中提取的主要蒽醌类化合物之一，化学名为1，8-二羟基-3-甲基蒽醌(1，8-dihydroxy-3-methy anthraquinone)，分子量为254.23，大黄酚具有改善学习记忆障碍、抗衰老的作用［1］，近期研究表明大黄酚具有改善阿尔采末病(Alzheimer's disease，AD)小鼠学习记忆和认知功能、提高抗缺氧化能力和耐力，通过清除体内自由基减少过氧化脂质的生成和增强抗氧化酶的活性，抑制乙酰胆碱酯(acetylcholinesterase，AchE)活性、提高脑血氧水平、降低脑组织一氧化氮(nitricoxide，NO)含量及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)等作用［2］。

铅是广泛存在于自然界中的一种有毒重金属，铅暴露能使细胞活性氧增加，破坏机体氧化/抗氧化动态平衡，改变抗氧化酶活性及脂质过氧化水平，从而导致细胞氧化损伤［3］。研究表明铅中毒与AD具有相同的靶部位，在铅中毒的动物和人脑可观察到AD样的老年斑(senile plaques，SPs)和神经纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)［4］。大黄酚是否具有改善铅中毒所造成的伤害目前尚未见报道，本实验就大黄酚对铅中毒小鼠学习记忆的影响及作用机制做进一步研究。

1 材料与方法

1.1 动物 健康、昆明种♂小鼠，体质量(20±2)g，由中国医学科学院实验动物中心提供。全部动物在实验室适应性饲养3 d后用于实验，分笼饲养，自由饮食和饮水，室温(20±2)℃。

1.2 药品与试剂 大黄酚(中国药品生物制品检定所生产)，实验前用N，N二甲基甲酰胺溶解，吐温80助溶，再加入生理盐水混匀，N，N-二甲基甲酰胺∶ 吐温80 ∶生理盐水 =1 ∶1 ∶8［5］;醋酸铅(天津化学试剂六厂);硝酸(天津耀华化学试剂有限责任公司);超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮(NO)试剂盒(硝酸还原酶法)、一氧化氮合酶(NOS)及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器 DWS-2 Morris水迷宫，SBA-2程控避暗箱:中国医学科学院药物研究所;PcLab生物信号采集系统:北京微信斯达科技开发有限责任公司;紫外-可见分光光度计:LabTech公司;AA-6800原子吸收分光光度计:日本岛津公司。

1.4 分组与给药 75只小鼠随机为5组，每组15只，分别为溶媒组(control group);铅中毒组(模型组，model group);大黄酚治疗组(Chry group，高、中、低剂量分别为 10.0、1.0、0.1 mg·kg－1)。铅中毒组和大黄酚各剂量组每天腹腔注射(peritoneal injection，ip)醋酸铅溶液7 mg·kg－1，溶媒组每天 ip等量的NS，连续注射8 d，然后停止注射3 d;染毒后d 4开始给药，大黄酚治疗组腹腔注射(ip)相应剂量的大黄酚(0.1 ml/10 g);溶媒组与模型组ip 0.1 ml/10 g溶剂(N，N-二甲基甲酰胺 ∶吐温80∶生理盐水 =1 ∶1 ∶8)，每天1 次，共14 d［6］。

1.5 行为学实验

1.5.1 避暗实验 给药结束后d 2进行避暗实验训练，24 h后以同样的方法进行测试，记录动物进入暗室的潜伏期(latency)以及3 min内错误次数(error count in 3 min)。行为学实验均在上午8:30分开始。

1.5.2 Morris水迷宫实验 给药结束后d 4开始水迷宫实验，每只动物连续训练4 d，每天训练4次，每次间隔30 min，每次从不同的象限入水，每次训练120 s，120 s内动物找到并爬到站台后让其停留20 s，若动物120 s内未能找到站台，则将其放置到站台上停留20 s，然后将动物取下站台。记录小鼠寻找站台的时间即潜伏期(latency)、120 s内游泳路径的长度(swimming distance)，未能找到站台的潜伏期按120 s记算。

1.6 取样及处理 行为学检测结束后，快速断颈处死小鼠并迅速取其全血(肝素抗凝)、左脑、右脑，分别用生理盐水洗净，吸干水称重，于－80℃保存备用。

1.7 小鼠血铅及脑铅含量测定 取1.0 ml全血，放入盛有10 g·L－1硝酸的带盖塑料离心管摇匀，采用石墨炉原子吸收法测定血铅含量，左脑用100 g·L－1硝酸消化定容，石墨炉原子吸收分光光度法测定脑内铅含量。

1.8 小鼠脑内生化指标的测定 取右脑，按试剂盒说明制备组织匀浆、离心，取上清液适量，按照试剂盒说明书分别测定SOD、MDA、GSH-Px以及NO含量、NOS、iNOS活力，采用考马斯亮蓝法测定组织蛋白含量。

2 结果

2.1 避暗实验中，大黄酚对铅中毒小鼠学习记忆障碍的影响 由Tab 1可见，连续8 d腹腔注射7 mg·kg－1醋酸铅，可以导致小鼠学习记忆障碍，模型组与溶媒组相比较小鼠进入暗室的潜伏期缩短，错误次数增加，且差异均有显著性(P＜0.01);大黄酚治疗组(10.0、1.0、0.1 mg·kg－1)可对抗铅中毒所致小鼠记忆障碍，各治疗组均可使小鼠进入暗室的潜伏期延长，错误次数减少，与模型组相比差异均具有显著性(P＜0.01)。

2.2 Morris水迷宫实验中，大黄酚对铅中毒小鼠空间学习记忆障碍的影响 由Fig 1，2可以看出，连续腹腔注射7 mg·kg－1醋酸铅8 d，可以导致小鼠空间学习记忆能力的障碍，随着训练天数的不断增加，模型组与溶媒组相比潜伏期、游泳路径延长;而大黄酚治疗组(10.0，1.0，0.1 mg·kg－1)可对抗铅中毒所致空间学习记忆障碍;在训练d4，与模型组相比大黄酚治疗组(10.0 mg·kg－1)可使潜伏期及游泳路径明显缩短(P＜0.01)。

Tab 1 Effects of Chry on error count in 3mins and latency in lead poisoning mice induced by lead acetate in step through test(±s，n=15)

Tab 1 Effects of Chry on error count in 3mins and latency in lead poisoning mice induced by lead acetate in step through test(±s，n=15)

＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs model

Group Dose/mg·kg－1Error count in 3 mins Latency/s Control － 0.31 ±0.44 142.00 ±52.13 Model － 3.61 ±1.47＊＊ 39.12 ±10.32＊＊Chry 0.1 2.30 ±0.66## 108.41 ±28.45##Chry 1.0 1.90 ±0.89## 124.21 ±21.59##Chry 10.0 1.60 ±1.31## 131.61 ±35.62##

Fig 1 Effects of Chry on the swimming distance of lead poisoning mice induced by lead acetate in morris water maze test(±s，n=15)

2.3 大黄酚对铅中毒小鼠脑内各种指标的影响

2.3.1 大黄酚对铅中毒小鼠脑内 MDA含量及SOD，GSH-Px活力的影响 由Tab 2可见，连续腹腔注射7 mg·kg－1醋酸铅8 d，可以导致小鼠脑组织内SOD和GSH-Px活性降低，使小鼠脑组织内MDA含量增加;连续ip大黄酚14d治疗后，与模型组相比，大黄酚0.1 mg·kg－1治疗组可升高 SOD和GSH-Px的活性(P＜0.01)，对MDA含量无影响;大黄酚 10.0、1.0 mg·kg－1治疗组可提高 SOD 和GSH-Px的活性，降低MDA含量(P＜0.01)。

Fig 2 Effects of Chry on the latency of lead poisoning mice induced by lead acetate in morris water maze test(±s，n=15)

2.3.2 大黄酚对铅中毒小鼠脑内NO含量及NOS，iNOS活力活力的影响 从Tab 2可以看出，连续腹腔注射7 mg·kg－1醋酸铅8 d，可以导致小鼠脑组织内NO含量增加，同时使小鼠脑组织内NOS和iNOS活性升高;连续ip大黄酚14 d治疗后，与模型组相比，大黄酚治疗组(0.1 mg·kg－1)可降低iNOS的活性(P＜0.05)，对NO、NOS含量无影响;大黄酚治疗组(10.0、1.0 mg·kg－1)可降低 NO 含量和NOS、iNOS的活性(P ＜0.01)。

Tab 2Effects of Chry on biochemical index in brain of lead poisoning mice induced by lead acetate(±s，n=15)

Tab 2Effects of Chry on biochemical index in brain of lead poisoning mice induced by lead acetate(±s，n=15)

＊＊P＜ 0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜ 0.01 vs model

Pro Control － 1.50 ±0.11 181.49 ±8.95 12.97 ±0.65 1 Group Dose/mg·kg－1 Biochemical index in brain MDA/μmol·g－1 SOD/U·mg－1Pro GSH-Px/U·mg－1Pro NO/μmol·g－1Pro NOS/U·mg－1Pro iNOS/U·mg－1 8.44 ±2.87 7.89 ±0.84 1.98 ±0.78 Model － 2.36 ±0.15＊＊ 102.33 ±7.45＊＊ 6.45 ±0.89＊＊ 24.15 ±2.94＊＊ 11.25 ±1.25＊＊ 3.85 ±1.12＊＊Chry 0.1 2.28 ±0.13 114.84 ±6.98## 7.95 ±0.68## 22.41 ±2.18 10.14 ±0.95 3.08 ±0.84#Chry 1.0 1.81 ±0.16## 122.61 ±5.27## 9.48 ±0.64## 20.78 ±1.96## 9.46 ±0.89## 2.54 ±0.97##Chry 10.0 1.77 ±0.19## 130.52 ±5.31## 10.41 ±0.71## 19.44 ±2.06## 8.75 ±0.87## 2.17 ±0.74##

2.4 大黄酚对铅中毒小鼠血铅、脑铅含量的影响连续腹腔注射7 mg·kg－1醋酸铅8 d，可以导致小鼠全血及脑内铅含量升高，模型组与溶媒组相比全血及脑内铅含量升高，差异具有显著性(P＜0.01);与模型组相比大黄酚治疗组(10.0、1.0 mg·kg－1)可降低全血及脑内铅含量;与模型组相比大黄酚治疗组(0.1 mg·kg－1)可降低脑内铅含量，对血铅含量无影响，见Tab 3。

Tab 3 Effects of Chry on the lead levels in blood and brain of lead poisoning mice induced by lead acetate(±s，n=15)

Tab 3 Effects of Chry on the lead levels in blood and brain of lead poisoning mice induced by lead acetate(±s，n=15)

＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs model

Group Dose/mg·kg－1 Blood/μg·L －1 Brain/μg·g －1 Control － 19.65 ±3.47 0.29 ±0.05 Model － 190.21 ±21.44＊＊ 1.34 ±0.18＊＊Chry 0.1 176.54 ±16.74 0.95 ±0.12##Chry 1.0 158.79 ±20.24## 0.89 ±0.13##Chry 10.0 148.14 ±15.95## 0.83 ±0.11##

3 讨论

铅具有很强的神经毒性，可引起学习记忆障碍，削弱机体的抵抗力［7］，同时铅暴露可引起钙平衡机制的破坏、影响一氧化氮合酶(NOS)、钙依赖蛋白激酶C(PKC)的活性，使神经递质谷氨酸(Glu)减少，这些皆可损害长时程增强(long term potentiation，LTP)使其不能产生或维持，从而影响学习记忆功能。染铅后脂质过氧化增强，而脑细胞富含脂质，易受自由基攻击而损伤。在正常情况下，机体内GSHPx、SOD、CAT及GSH等抗氧化物质可有效清除自由基，维持细胞氧化/抗氧化动态平衡;MDA是脂质过氧化的分解产物，其含量常常反映机体组织内脂质过氧化的程度［8－9］。本实验通过连续腹腔注射7 mg·kg－1醋酸铅8 d造成铅中毒小鼠模型，具有剂量准确、简便易行等优点;模型小鼠血铅与脑铅浓度明显升高，模型小鼠学习记忆能力及空间探索能力均出现不同程度的障碍，并出现明显的脂质过氧化损伤及iNOS/NO表达异常，与文献报道的铅中毒动物的表现一致［6］。

大黄酚是大黄中主要的蒽醌类成分之一，可以明显改善AD小鼠学习记忆能力，但大黄酚对铅中毒小鼠学习记忆障碍是否具有改善能力尚未见报道，作者研究发现腹腔注射大黄酚(10.0、1.0、0.1 mg·kg－1)可不同程度的改善铅中毒小鼠的学习记忆障碍和空间探索障碍，降低铅中毒小鼠血铅及脑铅水平，大黄酚可使铅中毒小鼠脑组织 SOD和GSH-Px活性升高，MDA含量降低;与模型组相比大黄酚可使铅中毒小鼠脑组织内NO含量降低，NOS和iNOS活性降低，大黄酚的上述作用有明显剂量依赖性，腹腔注射大黄酚10.0 mg·kg－114 d在改善铅中毒小鼠学习记忆及抗氧化损伤等方面都表现出良好的效果，可以为临床用药提供剂量参考;另外，研究发现大黄酚降低铅中毒小鼠脑中铅水平的能力较降低血铅的能力明显，腹腔注射0.1 mg·kg－1的大黄酚治疗组脑铅水平与模型组相比即差异有显著性，大黄酚治疗组(1.0 mg·kg－1)血铅水平与模型组相比差异才有显著性，这可能与大黄酚脂溶性高易穿透血脑屏障有关。综上所述，大黄酚改善铅中毒所导致的学习记忆障碍作用机制为:一方面通过提高机体清除自由基能力、减少自由基的产生;另一方面通过抑制iNOS/NO表达，抑制NO产生;大黄酚改善铅中毒造成的学习记忆障碍是否还具有其他方面的机制有待进一步研究。

总之，本实验的研究结果与大黄酚对AD小鼠学习记忆及脑内各种过氧化脂质指标和NO/NOS的影响是一致的［2］，这与铅中毒与AD在发病机制上具有一定的相似性的文献报道相吻合［11］，进一步提示用于治疗和预防AD的药物大黄酚可以考虑用于铅中毒的治疗与预防。

［1］ 陈琼华，戴汉松，苏学良.中药大黄的综合研究［J］.天然产物研究与开发，2001，13(3):58 －61.

［1］ Chen Q H，Dai H S，Su X L.Studies on Chinese rhubarb［J］.Nat Prod Res Devel，2001，13(3):58 －61.

［2］ 李淑娟，李春更，侯 勇，等.大黄酚抗衰老作用研究进展［J］.河北北方学院学报(医学版)，2009，26(1):70 －2.

［2］ Li S J，Li C G，Hou Y，et al.Advances of chrysophanol on anti-aging research［J］.J Hebei North Univ(Med Ed)，2009，26(1):70－2.

［3］ 梁 冰，李晓兵，张 伟，等.铅的污染危害及天然产物防治铅中毒［J］.四川环境，2000，9(2):17 －9.

［3］ Liang B，Li X B，Zhang W，et al.Harm of lead poisoning and use of natural materials to prevent and treat lead poisoning［J］.Sichuan Environment，2000，9(2):17 － 9.

［4］ 韦东禄，傅 雪，姜岳明.铅暴露与阿尔茨海默病［J］.工业卫生与职业病，2006，32(6):379 －82.

［4］ Wei D L，Fu X ，Jiang Y M，et al.Lead poisoning and Alzheimer's disease［J］.Ind Hlth ＆ Occup Di，2006，32(6):379 －82.

［5］ 董晓华，张丹参.大黄酚对Aβ25-35所致AD大鼠学习记忆及LTP 的影响［J］.中国药理学通报，2009，25(5):682 －5.

［5］ Dong X H，Zhang D S.Effects of chrysophanol on memory impairment and LTP in AD rats induced by Aβ25-35［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(5):682 －5.

［6］ 盛 凯，张国成，许东亮，等.银苓Ⅰ号对铅中毒小鼠驱铅及改善学习记忆能力研究［J］.实用儿科临床杂志，2005，20(3):247－50.

［6］ Sheng K，Zhang G C，Xu D L，et al.Effects of YinlingⅠon expelling lead and improving ability of learning memory in lead-poisoned mice［J］.Appl Clin Pediat，2005，20(3):247 －50.

［7］ 王明正，武冬梅，牛栓成.甲基黄酮醇胺盐对大鼠学习记忆的促进作用与其抗氧化作用的关系［J］.中国药理学通报，1998，14(2):154－7.

［7］ Wang M Z，Wu D M，Niu S C.Facilitating effect of methylflavonolamin on learning and memory and the correlations with its antioxi-dation in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，1998，14(2):154 －7.

［8］ Jonh D，Cremin J R，Donald R，et al.In vitro vs in vivo Pb effects on brain rotein kinase activity［J］.Environmental Res，2002，90(3):191－9.

［9］ Cornard J P，Dangleterre L，Lapouge C.Computational and spectroscopic characterization of the molecular and electronic structure of the Pb(Ⅱ)-quercetin complex［J］.Phys Chem A，2005，109:10044.

［10］南 娟，刘慧慧，杜艳霞，等.出生前后铝暴露对大鼠学习记忆及海马 NO、nNOS的影响［J］.中国药理学通报，2007，23(9):1152－5.

［10］ Nan J，Liu H H，Du Y X，et al.Effects of chronic alum inum exposure from prenatal to postnatal on learning and memory，NO，nNOS in hippocampus of young rat［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(9):1152 －5.

［11］沈丽霞，李淑娟，张丹参，等.大黄酚对小鼠记忆障碍的作用及其机制分析［J］.中国药理学通报，2003，19(8):906 －8.

［11］ Shen L X，Li S J，Zhang D S，et al.Effects of chrysophanol on memory impairment mice and its mechanism analysis［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19(8):906 －8.