融合蛋白GST-hRI对青光眼滤过术后瘢痕形成的改善作用

郝海峰，刘芳君，王冬梅，李静敏，田余祥

(1.大连医科大学生物化学教研室，辽宁，大连 116044;2.河南省护理职业学院解剖学教研室，

3.河南省护理职业学院生物化学教研室，河南安阳 455000;4.大连医科大学机能实验室，辽宁大连 116044;5.大连医科大学第二临床学院眼科教研室，辽宁大连 116023)

人核糖核酸酶抑制因子(human ribonuclease inhibitor，hRI)是广泛存在于哺乳动物细胞质中的一种酸性蛋白质(pI=4.7)，分子量约为50 ku［1］。hRI含有32个高度保守的半胱氨酸残基，其中至少30个半胱氨酸的巯基处于还原状态，还原型巯基是保持RI正常生物学活性所必需的［2］。hRI基因定位于染色体11p15.5，其cDNA全长1 698 bp。我们的前期研究表明，hRI具有抗氧化损伤的作用［3］。血管生成因子Angiogenin具有促进新生血管形成的作用，hRI与其紧密结合后，强烈抑制Angiogenin的活性。应用hRI后，一些实体瘤细胞生长明显受到抑制，瘤组织周边的新生血管明显减少［4］。本文通过研究重组GST-hRI对青光眼滤过术后瘢痕形成的抑制作用，为GST-hRI的研发应用提供重要的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和菌株 大肠杆菌Rosetta和重组质粒pGEX-6p-1-hri由大连医科大学生物化学教研室保存和构建。

1.1.2 主要试剂 胰蛋白胨、酵母提取物购自OXODID公司;RNaseA、酵母RNA购自Sigma公司;山羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗购于华美生物工程公司;Glutathione-Sepharose 4B亲和层析柱购自上海索莱宝生物科技有限公司。兔抗人RI抗体由本实验室制备和提纯。

1.1.3 主要仪器 TDL 40B高速低温离心机(德国Zentifug公司);Tanon GIS-100凝胶成像系统〔天能科技(上海)有限公司〕;YZ-5C2型裂隙灯(苏州医疗器械厂)。

1.1.4 实验动物 新西兰大白兔，体质量1.5～3.5 kg，♀♂各半，由大连医科大学动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pGEX-6p-1-hri在大肠杆菌Rosetta中的诱导表达 选取携带有重组质粒pGEX-6p-1-hri的大肠杆菌Rosetta划线接种于含100 mg·L－1氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂平板固体培养基上，置于37℃恒温孵箱中，培养16 h。选取一单菌落接种于20 ml LB培养基(含100 mg·L－1Amp，10 g·L－1胰蛋白胨，5 g·L－1酵母提取物，10 g·L－1NaCl)中，37℃培养过夜。次日将此培养物加至1 000 ml LB培养液(含100 mg·L－1Amp)中，继续培养至 OD600=0.4，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol·L－1，在16℃继续培养12～16 h。

1.2.2 融合蛋白GST-hRI的纯化、鉴定及活性测定 将诱导培养12～14h后的菌液于4℃下，15 000×g离心20 min，收获细菌。用裂解缓冲液悬浮沉淀，冰浴超声。15 000×g离心30 min，收集上清及沉淀，取上清1 ml检测GST-hRI活性及电泳鉴定，其余菌液以20 000×g离心30 min，收集上清，取100 μl沉淀及上清电泳鉴定。将活化后的Glutathione-Sepharose 4B(按试剂说明操作)装柱后，用PBS溶液平衡，将上清液经0.45 μm滤膜过滤后，将滤液上柱。用PBS洗脱，再用洗脱缓冲液洗脱GST-hRI，收集流出液，用SDSPAGE鉴定，采用Bradford法测定流出液中GST-hRI的含量和活性［5］。

1.2.3 建模、分组和给药 取新西兰大白兔24只，♀♂各半，体质量1.5～3.5 kg。随机分成6组。分别为正常对照组、模型对照组、低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组和GST对照组。术前3 d用0.25%的氯霉素滴眼液滴眼，清洁角膜、结膜及结膜囊，每天4次。腹腔注射3%的戊巴比妥钠(30～50 mg·kg－1)麻醉，用庆大霉素清洁眼球、结膜囊，并用0.5%盐酸丙美卡因局麻3次。开睑器开睑，切除角膜小梁组织，在巩膜瓣两个后角间断缝合各1针，缝合结膜。术毕结膜下注射地塞米松2.5 mg及庆大霉素20 000 U。术后当天每30 min用0.25%的氯霉素滴眼液滴眼1次。术后d 2，氯霉素滴眼，每天4次，正常对照组不加任何处理，其他各组分别用生理盐水、低剂量GST-hRI(50 U·kg－1)、中剂量 GST-hRI(100 U·kg－1)、高剂量 GST-hRI(200 U·kg－1)和GST(0.2 mg·kg－1)滴眼，每天3次，连续2周。

1.2.4 疗效观察 按Kronfeld分型法记录滤过泡类型，统计和计算各组中功能性滤过泡所占比例。d 14处死是实验动物，取手术区8 mm×8 mm范围组织，制备HE染色切片。1.2.5 数据处理 所有分析均采用SPSS软件分析。

2 结果

2.1 重组质粒pGEX-6p-1-hri在大肠杆菌Rosetta中的诱导表达鉴定 在16℃，IPTG终浓度为0.5 mmol·L－1条件下，诱导表达12 h，可溶性融合蛋白GST-hRI的表达量最大。

2.2 亲和层析纯化后GST-hRI含量和活性测定 亲和层析纯化后，测得GST-hRI蛋白含量为0.413 g·L－1，活性为9×103U·ml－1。

2.3 疗效观察 生理盐水组和GST组的非功能滤过泡均为100%。低剂量组功能性波过泡占总比例的83.3%，中剂量组占87.5%，高剂量组占100%。与模型对照组和GST对照组比较差异有显著性(P＜0.05)(Tab 1)。镜下观察手术区血管增生情况发现，GST-hRI治疗组新生血管形成明显少于模型对照组和GST对照组，并随着剂量的增加，GST-hRI对血管形成的抑制作用增强，表现出剂量依赖关系。

Tab 1 Effect of GST-hRI on the formation of filter blebs

3 讨论

青光眼是一种以眼压升高为主要症状的致盲性眼病，致盲率居第3位。滤过性手术失败的主要原因就是由于手术区新血管生成和瘢痕的形成，导致功能性滤过泡不能形成。在瘢痕修复愈合过程中，有许多生长因子对新生血管生成有重要的调节作用［6］。血管形成因子Angiogenin是一种单链碱性蛋白质(14.4 ku)，具有强烈的诱发血管生成的活性［7］，特别是在术后早期形成的肉芽组织中，由于血管内皮生长因子(VEGF)、创伤等刺激下，Angiogenin高表达，诱导新血管生成，使伤口愈合，瘢痕形成［8］。

人核糖核酸酶抑制因子由460个氨基酸残基组成，分子中含有32个半胱氨酸残基，至少有30个处于还原状态，为hRI抗氧化功能所必需。hRI与Ang具有极强的亲和力，hRI与Ang的紧密结合，强烈地抑制其促新生血管生成的作用［9］。

本研究的结果表明，兔眼小梁切除术后，滴用可溶性表达的融合蛋白GST-hRI，明显促进功能滤过泡的形成，明显抑制了术后滤过道新生血管的形成，减少瘢痕的形成，减轻滤过道阻塞，从而可以提高青光眼滤过手术的成功率。hRI可以作为青光眼小梁切除术的辅助药物，并可用于新生血管性青光眼的预防。

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