噬菌体展示肽库技术及其在分子病原细菌学研究中的应用

赵红蕾,刁昱文,冯 新,高 宇,刘珊珊,顾敬敏,雷连成,韩文瑜

(吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062)

1 概 述

近年来,抗菌药物耐药性成为需要紧急采取行动的全球问题,迫切需要寻找能有效杀伤病原微生物,且不易形成耐药性的新型抗微生物制剂或具有防御作用的新型疫苗。基于噬菌体展示技术的病原体抗原表位分析既是研究抗原分子的结构和功能、抗原—抗体反应机制的基础,又可为多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要的线索和依据[1]。

噬菌体表面展示技术是Smith于 1985年首先建立起来的一种新的生物技术[2],它将外源基因插入丝状噬菌体基因组中,从而使表达的外源肽或蛋白与噬菌体衣壳蛋白融合而展示在噬菌体表面,被展示的蛋白或肽可以维持相对稳定的空间结构和生物学活性[3,4]。1990年,Scott等[5]首次将随机序列肽与丝状噬菌体表面蛋白g融合展示在噬菌体表面,建立了噬菌体展示随机肽库。之后,噬菌体肽库技术讯速发展,已广泛用于抗原表位筛选、免疫学诊断、疫苗研制、药物筛选等方面,尤其在蛋白质结构研究[6]、抗原表位分析[7]、人工抗体制备[8]、激素或病毒受体结合序列及酶的底物或抑制剂序列的确定、细胞因子拮抗剂的研制和寻找细胞内信号蛋白等研究中发挥重要作用[9]。笔者从噬菌体展示技术的基本原理、肽库的构建、噬菌体肽库的分类、噬菌体肽库的筛选方法等方面,综述了噬菌体展示肽库技术;从抗原表位研究、免疫诊断研究、基因疫苗研究、抗菌药物的靶向投递等方面,阐述了噬菌体展示肽库技术在分子病原细菌学中的应用;并对今后的研究方向进行了展望。

2 噬菌体展示肽库技术

2.1 噬菌体展示技术的基本原理

噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体衣壳蛋白结构基因的适当位置,在阅读框正确且不影响其衣壳蛋白正常功能的情况下,使外源多肽或蛋白与衣壳蛋白融合表达,融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性,以利于靶分子的识别和结合。肽库与靶蛋白分子经过一定时间孵育后,洗去未结合的游离噬菌体及亲和力较弱的噬菌体,然后以竞争性受体或酸性洗脱剂洗脱与靶分子强力吸附的噬菌体,洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增,再进行下一轮洗脱。经过 3～5轮的“吸附—洗脱—扩增”后,与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。而后通过测序分析可以得到多肽基序而用于下一步的疫苗研究、诊断元件构建或其它目的[10,11]。

2.2 肽库的构建

噬菌体随机肽库是由上亿种与噬菌体外壳蛋白以融合的形式呈现在噬菌体表面的多肽所组成,库中上亿种多肽分别呈现在上亿个噬菌体表面,众多重组型噬菌体便组成了噬菌体随机肽库。构建肽库的关键是获得足够的独立噬菌体克隆。以 6肽为例,至少应获得 107～109以上的独立克隆。肽库的建立基于以下事实:(1)含有关键残基的小肽可以模拟蛋白质上的结合位点(抗原决定簇);(2)蛋白质之间的相互作用及识别是通过局部肽片段的相互作用实现的。噬菌体肽库技术是噬菌体展示技术同生物进化理论相结合的产物。

在噬菌体展示随机多肽库的构建策略中,大多数的肽库是将随机多肽片段与 pⅢ的N末端融合而展示于噬菌体表面,也有一部分肽库采用pⅧ的N端展示。pⅢ允许展示较大的蛋白质,大至 50 ku的蛋白质己被成功展示,其在病毒颗粒上只含有少数几个拷贝,因而对于获得高亲和力的多肽很有好处,故pⅢ几乎是目前所有噬菌体展示库的骨架。而pⅧ只能融合较小的外源肽段,携带肽段太大会影响噬菌体粒子的组装与感染能力,但其拷贝数高,重组噬菌体作为免疫原时,可产生良好的免疫应答反应,在疫苗研制中应用价值大。

目前,肽库的构建主要有两种途径:一是有机合成法,二是基因合成法。前者是直接用固相肽合成技术,合成含有各种可能序列的短肽。基因工程方法是将编码各种序列特定长度短肽的目的基因克隆进表达载体,与噬菌体的外壳蛋白基因融合表达,使得一个噬菌体上含有一种序列的肽。目前使用的噬菌体载体大多是在pⅢ或 pⅧ基因区通过定点突变引入适宜的酶切克隆位点,同时在其下游插入抗生素抗性基因和包含复制起始位点的DNA片段构建而成。

2.3 噬菌体肽库的分类

噬菌体肽库依据外源融合多肽的构象是否被限制,可分为两类:一类为展示于噬菌体表面的多肽,其构象不受限制,即没有束缚其外源融合多肽构象的二硫键存在,呈线性状态;另一类为构象限制的肽库,其特点是外源随机肽两侧各有一个 Cys残基,在噬菌体表面形成二硫键,它与受体的亲和力比线性肽库要高。在筛选受体的相应配基时,使用构象限制性肽库比使用完全随机肽库更容易获得成功。另外,噬菌体肽库依据展示于噬菌体外膜上外源融合多肽的拷贝多少形式的不同,可相应地分为单价多肽噬菌体库和多价多肽噬菌体库。目前,根据噬菌体载体的不同,噬菌体展示系统主要分为:丝状噬菌体系统、λ噬菌体系统、T4噬菌体系统以及T7噬菌体系统。

2.4 噬菌体肽库的筛选方法

目前,国内外文献报道的噬菌体展示肽库筛选方法有很多种,如:固相纯化抗原筛选、液相筛选法(磁珠筛选)、全细胞筛选、动物体内筛选、血清筛选等。能否从肽库中筛到特异性强的噬菌体克隆受到多个因素的影响,其中,筛选方法的合理应用在很大程度上起着决定性作用。

2.4.1 固相筛选法 固相纯化抗原筛选最早的办法是用抗原包被 ELISA板,方法与常规的ELISA方法相似,但抗原浓度要适当提高。近年来,不断有文献报道通过改进固相筛选方法取得了很好的效果[12,13]。

固相筛选法操作简单,筛选出阳性克隆的几率高,但需要纯化大量的靶蛋白纯品,而且不易根据抗体库和抗原的性质进行量化处理,因而针对抗体的亲和力有所选择时此法效果欠佳。同时,固相筛选出的抗体有时不能与天然抗原结合,并且要求抗体库的库容量较大。

2.4.2 液相筛选法 液相筛选法将抗原用生物素标记后在液相中利用链亲和素磁珠借助磁场的作用进行多肽噬菌体筛选。其优点是增加了噬菌体颗粒与抗原接触的几率,提高了筛选效率;筛选体系可以根据抗体库的库容、抗原的相对分子量和纯度等对筛选体系进行调整;可预先确定所期望抗体的亲和力,选择性地筛选到不同亲和力的噬菌体抗体[14]。但是液相筛选获得的克隆特异性比较差。

2.4.3 体内筛选法 体内筛选方法将常规的噬菌体展示技术与动物荷瘤模型相结合,进行肿瘤或其内部血管上特定配体的筛选。体内噬菌体展示技术除了具备常规的噬菌体随机肽库快速、高效的特性外,还因为该筛选过程主要在动物体内进行,能够充分模拟人体内环境,并最大程度地保持感兴趣组织或细胞上各种配体的天然构象,可以较好地评价目标筛选物亲和吸附的特异性及偶联药物后的临床效果[15]。但是体内筛选的特异性较差,容易筛得与血管壁或成纤维细胞等其他非特异性的噬菌体。而且,体内筛选周期长、操作复杂,容易出现噬菌体序列的丢失。

2.4.4 全细胞筛选法 全细胞筛选可以获得针对细胞膜表面分子的特异性多肽,而且细胞膜表面分子以天然状态存在,应用此方法筛选更容易获得有功能的小肽[16]。并且全细胞筛选具有简单、高效的优点,在筛选过程中试验条件可控性强、影响因素小,实验结果重复性高,是最常用的方法。但是细胞表面的目的蛋白含量较低,蛋白成分复杂,筛选的难度很大。

不同的筛选方法各具优势,在实际的筛选过程中,应当根据抗体库的库容、抗原的性质和纯度、筛选的目的,合理地选择筛选方法,从而获得更有效的结果。

3 噬菌体展示肽库技术在分子病原细菌学中的应用

近年来,噬菌体随机肽库技术不断被改进和完善,在生命科学的众多领域得到了广泛应用,在分子病原细菌学方面的应用主要表现在抗原表位筛选[5,17]、免疫学诊断[18～20]、疫苗研制、药物筛选及靶向投递[16]等方面。

3.1 抗原表位研究

抗原表位是抗原分子中与抗体或致敏的淋巴细胞结合的部位,有线性表位和构象型表位两种类型,线性表位的氨基酸序列在一级结构上是连续的,而构象型表位是由一级结构上不连续的氨基酸残基经过肽链折叠而在空间聚集在一起形成的一定的空间结构。在完整蛋白质产生的抗血清中,抗构象型表位的抗体占 90%,只有 10%的抗线性表位抗体。

传统的抗原表位分析主要是通过分析抗原经物理化学降解得到的片段或人工合成一系列来源于抗原的肽段与相关抗体的结合活性而得到,此方法成本高,必须首先确定蛋白质的氨基酸序列,才能合成相应的肽,而在实际研究中,许多蛋白质的序列并不清楚。此外,由于表位多数情况下为包含结合受体所必需的某些氨基酸不连续的空间构象,仅少数为一段连续的线性氨基酸残基,因此线性的合成肽仅能模拟蛋白质的线性表位,无疑会丢失众多的构象型表位信息。

噬菌体肽库技术将抗体作为受体暴露于肽库中筛选到能与特异性抗体相结合的重组噬菌体肽的序列,弥补了合成肽筛选的不足。噬菌体随机肽库技术研究分析抗体所识别的抗原表位具有以下优点:(1)噬菌体多肽易生产和分离,价廉;(2)噬菌体稳定且保存时间长;(3)可进一步改造以满足不同的需要;(4)噬菌体具有免疫原性,因而作为疫苗免疫时无需佐剂;(5)提供了一种快速鉴定免疫优势中和抗原决定簇的有效方法。

目前,以纯化的单抗为靶标筛选抗原模拟表位的应用最广泛也最为成熟,为在未知条件下分离病原体的表位,或作为诊断试剂提供了广阔的应用前景。国外学者已成功地筛选到不连续的与原始抗原没有同源性的乙肝病毒(HBV)[21]、丙肝病毒(HCV)[22]、人类免疫缺陷病毒(HIV)gp 120蛋白[23]的模拟表位序列,这些序列均具有很强的免疫原性,不需要添加任何佐剂,所激发的抗体既能识别模拟表位抗原也能识别原始抗原。这些模拟表位抗原可以避免完整抗原的毒性作用并可以避免产生不需要的非中和抗体。同时利用噬菌体随机肽库还可以模拟一些半抗原和不具有免疫原性的物质,从而研制一些模拟肽药物,如对肺炎球菌等一些细菌疫苗的研制都从模拟肽入手获得了一定突破[24]。郭奕阳等[25]借助基因工程手段获取了含有McAb2相应表位的融合蛋白及预期表位缺失蛋白,并利用噬菌体肽库筛选 McAb2结合的关键位点,进而对该结合位点是否与 FH和 Fba蛋白的结合位点相重叠进行了研究,为进一步探索 Fba蛋白在GAS致病机制中的作用,鉴定 McAb2的功能及制备表位肽疫苗奠定了基础。李妍等[26]通过利用噬菌体随机肽库技术筛选出 THp主要保护性抗原UreaseB,Lpp20,Catalase的B细胞表位,从而初步建立了Hp主要保护性抗原 B细胞表位鉴定的研究平台,为Hp表位疫苗的研制奠定了一定的理论基础。

3.2 免疫诊断研究

感染性疾病患者血清中含有针对抗原的各种抗体,但只有在天然抗原是微生物或者是已被克隆表达的情况下才容易获得纯抗原来鉴定特异性的抗体,而利用噬菌体随机肽库技术筛选到的小肽分子可以和患者体内的抗体相结合,从而发现患者血清中的特异抗体,可由此用于快速、特异性地诊断疾病。

Nathan等[27]构建了 1个针对热带病原菌(类鼻疽杆菌属)的人鼠嵌合抗体 Fab库,并利用此库筛选出针对蛋白酶的克隆,分析了其作为蛋白酶抑制剂的功能。体外实验证明,纯化的 Fab有抑制该蛋白酶的能力,并对致病性蛋白酶有专属性。Saldarelli等[28]应用噬菌体展示技术建立了人源重组抗体库,从中获得 15株对B型葡萄病毒有特异性的重组ScFv抗体。其中 2株的编码基因在重组中以二聚体形式表达,用该二聚体ScFv抗体成功地在草本植物,葡萄树的组织中直接检出了 B型葡萄病毒,该抗体被认为可有效代替 B型葡萄病毒的多克隆血清,建立新的 DAS ELISA试验标准,用于常规诊断。

3.3 基因疫苗研究

运用肽库的最大优点是不需要靶蛋白的任何结构,只需利用其抗体或受体来捕获噬菌体肽库中的小配体,并可大量繁殖,这为疫苗的设计生产提供了极大方便。利用噬菌体展示肽库亲和淘筛可以得到一些抗原的模拟表位,这些模拟抗原除了能模拟天然抗原的结构外,还具有一定的免疫原性,能像天然抗原一样刺激机体免疫系统产生免疫反应,由它产生的抗体能与真正病原体上的天然表位反应,这有利于将发现的表位作为人工合成疫苗的一个组分,在疫苗设计方面有着广泛的应用前景[29]。

非典型嗜血流感杆菌(NTHi)是导致儿童中耳炎和成人下呼吸道疾病的常见原因。到目前为止,尚无有效的疫苗来防治。NTHi的一个主要表面蛋白混合寡糖(LOS)是重要的毒力因子。LOS毒力很强,以致于在体内很难被控制,但是去毒的 LOS是不依赖于T细胞的小分子,而且在体内的免疫原弱。Hou等[30]将噬菌体展示 12肽库与抗 NTHi LOS的兔抗体反应,以期得到模拟LOS抗原。结果表明,得到的合成肽使兔产生了一定的抗NTHi LOS能力。

3.4 抗菌药物的靶向投递

传统的新药开发,由于对蛋白质结构与功能关系不够了解,只能通过大规模的定点突变和费时的单个目的蛋白的克隆表达纯化与筛选来修饰现有蛋白。

随着人类对细胞认识的不断深入,人们更多从分子水平来阐述细胞间的作用机制[31]。已经明确,受体是细胞同外界联系的通道,各种生物因子(包括某些药物)都是通过同受体结合而产生相应的生物效应。而噬菌体展示肽技术只要以一定功能的靶分子为受体,在天然蛋白质或特定功能的框架分子噬菌体展示文库中筛选配体,就可以简便快速地获得与靶分子具有强亲和力和特异性的小肽或新型蛋白,可作为受体的激动剂或拮抗剂[32],分析其结构就可以合成相应的药物,作为候选药物或用于抗菌药物的靶向投递。

噬菌体随机肽库技术用于病原菌导向治疗研究主要集中在 3个方面:①筛选病原菌抗原表位特异性结合肽,与药物耦联后用于病原菌的药物靶向投递和治疗;②筛选与病原菌致病性相关蛋白的结合肽,为病原菌免疫诊断提供了一个有前途的方法;③筛选病原菌相关抗原表位和蛋白结合肽后与基因耦联,用于药基因疫苗设计和基因治疗。

4 问题与展望

噬菌体肽库对于连续、不连续的或非肽表位(即糖蛋白)都具有良好的筛选作用,是研究复杂生物系统有用的工具。通过筛选得到的生物活性肽是构建“生物导弹”的基础,至今据报道建立在这种基础上的肿瘤导向治疗表现出高效性和高安全性,其在病原细菌学中的应用也越来越受国内外专家学者的关注。

当然需要指出的是,噬菌体的建库过程仍然依赖于 DNA的转化,因而实际存在的肽库的多样性是有限的。肽本身的单一性也限制了对于复杂蛋白质分子的研究。而且筛选到的具有高亲和力的生物活性肽与抗微生物药物结合必须以不改变两者特异性为前提,在结合后也应以病原体抗原表位为靶标实现准确地导向杀伤。虽然这样,我们仍然可以用随机肽库筛选出的新的配体成为基因或药物传递治疗的载体,为病原菌治疗开辟一条新途径。

总之,噬菌体肽库是噬菌体展示技术在近些年来发展起来的重要分支,其具有高库容、高效方便及灵活的筛选技术等特点,使其在许多方面如功能基因组学、药物设计和寻找新配体等占有重要地位。随着筛选靶标范围的扩展及相应的更加完善的筛选方法的建立,噬菌体展示肽库技术必将为生物技术领域的发展,尤其是病原菌方面的研究和应用带来巨大的推动。

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(责任编辑:朱宝昌)