溶藻细菌YZ对铜绿微囊藻的溶藻特性研究

牛丹丹,郑青松,刘兆普,张 娜,汪 辉,姚 瑶 (南京农业大学资源与环境科学学院,江苏省海洋生物学重点实验室,江苏 南京 210095)

溶藻细菌YZ对铜绿微囊藻的溶藻特性研究

牛丹丹,郑青松,刘兆普*,张 娜,汪 辉,姚 瑶 (南京农业大学资源与环境科学学院,江苏省海洋生物学重点实验室,江苏 南京 210095)

为了进一步研究本实验室前期从青岛一池塘分离出的溶藻细菌YZ的溶藻效应.考察了不同量的YZ无菌滤液对铜绿微囊藻生长量、叶绿素含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性、PSⅡ实际光能转化效率、最大相对电子传递效率、光能利用效率的影响.结果表明,在一定范围内,YZ溶藻效果与加入的无菌滤液的量成正比.当100mL中加入超过10mL的基础柠檬酸培养基时,铜绿微囊藻的生长即受到抑制.YZ无菌滤液使其丙二醛含量显著上升,微藻的SOD活力在处理6,72h时显著上升,溶藻细菌YZ滤液可以在72h内使藻细胞的PSⅡ实际光能转化效率、最大相对电子传递效率、光能利用效率等显著下降.YZ无菌滤液主要是通过降低保护酶活性、加大膜脂过氧化、显著抑制光合能力,起到对铜绿微囊藻的溶解作用.

溶藻细菌YZ；铜绿微囊藻；溶藻；叶绿素荧光特性

溶藻细菌是指以直接或间接方式抑制藻类生长或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌[1].近年来,有关溶藻的细菌菌株的报告愈来愈多[2-6].探究藻菌关系和溶藻细菌对水体进行生态修复成为国内外研究的热点领域[7-8].本实验室前期分离到的溶藻细菌 YZ是一类间接溶藻的细菌,即分泌溶藻物质于胞外,这种溶藻物质具有很强的溶藻作用,通过对藻细胞数目的测定,显示在短期内溶藻率可达到 90%[9].本试验进一步研究了 YZ无菌滤液对藻细胞的叶绿素含量、光合作用以及抗氧化系统指标等的影响,以期为溶藻细菌 YZ的生产和应用提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和藻种 本实验室分离得到的溶藻细菌 YZ经鉴定为无色杆菌属(Achromobactersp.)[9],保存于-70℃冰箱中.

铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)来源于中国科学院水生生物研究所藻种保藏中心.25℃恒温,2500lx光照培养,光暗比为12h : 12h.

基础柠檬酸培养基[10],用于溶藻细菌的富集培养,可直接加入藻液中.该培养基成分(g):NH4H2PO40.1,K2HPO40.1,NaCA30.05,MgSO4·7H2O 0.02.蒸馏水 100mL.

BG11培养基,用于铜绿微囊藻的培养,成分为 (g):NaNO31.5,K2HPO40.04,MgSO4·7H2O 0.075,CaCl2·2H2O 0.036,Na2SiO3·9H2O 0.058,柠檬酸 0.06,柠檬酸铁铵 0.006,EDTA 0.001,Na2CO30.02.A5 溶液 1mL,蒸馏水 999mL.A5溶液成分为(mg): H3BO3286,MnCl2⋅4H2O 181,ZnSO4⋅7H2O 22,CuSO4⋅5H2O 7.9,Na2MoO4⋅2H2O 3.9,蒸馏水100mL.

1.2 试验方法

1.2.1 不同浓度的基础柠檬酸培养基对铜绿微囊藻的生长的影响 向100mL的铜绿微囊藻液中分别加入不同浓度(0,6,8,10,12,14mL)的基础柠檬酸培养基,分别于0,48,96,144,192,240h时取一定体积的铜绿微囊藻液,以未接入基础柠檬酸培养基作为对照(CK),测定其在680nm的OD值.

1.2.2 不同量的 YZ无菌滤液的溶藻试验 将YZ接种至牛肉膏蛋白胨中,37℃,170r/min培养至对数期,取0.3mL该菌液转接入100mL基础柠檬酸培养基中,相同条件培养 28h,使细菌进入稳定期,此时的菌液密度达到 108cfu/mL.用 0.45μm的滤膜重复过滤菌液,将 YZ无菌滤液以不同量(0,6,8,10mL)加入到100mL藻液中.每组设2个平行,以接入0mL无菌滤液做为对照(CK),每2d取样,于680nm测定其OD值.并建立藻细胞数目与OD值关系曲线.

1.2.3 叶绿素含量的测定 采用德国WALZ公司生产的浮游植物荧光仪(Phyto-PAM)进行铜绿微囊藻叶绿素含量的测定.测定前,用丙酮法校正,并用空白BG11培养基调节zoff值[11-12].

1.2.4 丙二醛(MDA)含量、超氧化物岐化酶(SOD)活性的测定 取一定量藻液,4℃离心(8000r/min)收集藻细胞加少量磷酸缓冲液(pH 7.8)和少量石英砂在冰浴中研磨,匀浆液4℃离心(8000r/min)20min,收集上清液,保存在-70℃下,用作MDA含量及SOD活性测定[13].MDA的测定采用TBA法,按文献[14]计算MDA含量. SOD的活性测定参照文献[14],根据公式即可算出其活性.

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1.2.5 叶绿素荧光特性的测定 采用德国WALZ公司生产的浮游植物荧光仪(Photo-PAM)对实际光能转化效率(Yield),光能转化效率(α),最大电子传递速率(Pm)测定.取一定体积的铜绿微囊藻液,进行短时间(5min)的暗适应[15].测定前,用BG11空白培养基调整其zoff值.以消除培养基内物质的荧光干扰.因此,在实际测定中,每个指标用相同浓度的藻液重复测定3次.

试验所有数据用平均值±标准差(x±s)表示,数据采用SPSS软件进行分析.

2 结果

2.1 藻细胞数目和吸光值关系的测定

由图1可知,在一定的范围内,藻细胞的数量是随着吸光值的增加而增加的,因此,通过对藻液吸光值的测定,可知藻细胞的数量.

2.2 不同浓度的基础柠檬酸培养基对铜绿微囊藻生长的影响

由图 2可知,向 100mL藻液中分别加入6,8,10mL的基础柠檬酸培养基,与对照组相比,对铜绿微囊藻的生长几乎没有影响,藻液没有黄化,且其OD值一直在增加,说明藻细胞一直在增长.当向100mL藻液中加入12mL的基础柠檬酸培养基,48h时,藻液外观上没有明显的变化,藻细胞数目在增加,但随着时间的延长,在加入后的96,144,192,240,288h,藻细胞的生长受到了抑制.当向100mL藻液中加入了14mL基础柠檬酸培养基,48h,藻细胞的生长受到了抑制,其吸光值开始下降,随着时间的延长,这种抑制愈加明显.在288h,藻细胞的数目与0h相比,下降了65%.由此可见,当向藻液中加入过多的基础柠檬酸培养基中,对溶藻效果造成干扰.

2.3 不同量的YZ无菌滤液的溶藻效果

由图3可知,YZ无菌滤液的量与溶藻效果成正比.加入 6,8mL,铜绿微囊藻的生长即受到影响,加入 10mL的无菌滤液的的现象更明显.向100mL藻液中分别加入6,8,10mLYZ无菌滤液,48h时,藻液颜色变化均不明显;96h时,藻液均出现轻度黄化,藻细胞的数目分别减少了8%、11%、14%.144h时,这一减少数值分别为18%、20%、21%.192h时, 这一减少数值分别为26%、30%、34%.240h时,藻细胞的数目分别减少了 34%、37%和 70%.288h时,藻细胞的数目分别减少了38%、45%、78%.向100mL中加入10mL的YZ无菌滤液,288h(12d)后,藻液即呈现白色.

如图4所示,在100mL藻液中加入YZ无菌滤液10mL,72,144h时,微囊藻的叶绿素含量与0h相比差异不显著,216h后,微囊藻的叶绿素含量显著下降,比 0h降低 23%,此时藻液颜色明显变黄.滤液加入 288h,叶绿素含量下降 88%,藻液变白;而加入同等体积空白培养基的对照组(CK)的藻细胞的叶绿素含量呈逐渐上升趋势.

2.5 无菌滤液对藻细胞MDA含量、SOD活性的影响

图5 无菌滤液对铜绿微囊藻MDA含量和SOD活性的影响Fig.5 Effects of the bacteria-free filtrate on the MDA content and the SOD activity of M. aeruginosas

加入 YZ无菌滤液(在 100mL藻液中加入10mL YZ 无菌滤液)前,对照组(CK)与处理组(加入无菌滤液)的MDA含量和SOD活力均相当(图5).但加入无菌滤液 6h后,其 MDA 含量即增加150%,随着时间的延长,MDA 含量增加愈显著,处理72,216,288h,MDA含量分别增加193%、414%和 450%(图 5a);加入滤液 6h,其 SOD 活力增加116%,处理 72h,SOD活力增加178%,但加入滤液288h,SOD活性显著下降,但仍比0h的高.对照(CK)的酶活性也随着时间的延长呈现逐渐上升,但在6,72h,均显著低于处理的SOD活性(图5b).

2.6 无菌滤液对铜绿微囊藻Yield, α,Pm的影响

加入YZ过滤液(在100mL藻液中加入10mL YZ无菌滤液)后,藻细胞内的 Yield,α, Pm均出现了明显的下降(图6),处理72,144,216,288h, Yield分别下降23%,72%,94%和97%,α分别下降46%,97%,99%和 99%, Pm分别下降 46%,94%,97%和98%.相对Yield来说,α和Pm下降更显著.

3 讨论

YZ是一种间接溶藻的菌种,溶藻作用的因子不是细菌本身,而是它分泌的胞外非蛋白类活性物质[9].杨晓新等[16]在观察溶藻细菌对棕囊藻(Phaeocystis globosa)溶解过程时,发现藻菌共培养后24h即出现溶藻现象,72h绝大部分的藻细胞都被溶解了.溶藻细菌对棕囊藻的溶藻过程为:少数溶藻细菌吸附棕囊藻细胞表面,然后随着共同培养液中溶藻细菌增多,细菌在藻细胞表面周围聚集也增加,被作用的棕囊藻细胞表层开始破裂,藻细胞内容物溶出,棕囊藻被溶解.这一过程循环往复,细菌又向新的目标藻发起进攻,发生相类似的溶藻过程,直至藻液中的藻细胞全部被溶解.通过荧光显微镜对 YZ溶藻过程观察,YZ溶藻物质能使藻细胞破碎,胞内物质外流,导致藻细胞死亡[9].MDA含量是生物细胞膜脂过氧化的重要指标,表明细胞膜完整性被破坏的程度[15].本研究表明,MDA的含量始终处于增加的状态,说明随着处理时间的延长,藻细胞膜脂过氧化程度不断加深,藻细胞的完整性被破坏,从而达到溶藻目的.生物在逆境下总能表现出一定的自我保护能力,SOD在生物抗氧化酶类中处于核心地位,它是第一个参与清除活性氧的保护酶[13].史顺玉[13]在研究多株溶藻细菌对铜绿微囊藻细胞抗氧化系统的影响结果表明,在第 4d,藻细胞的 SOD活性最强;在加入溶藻细菌的第6、7d,其MDA含量即有了明显的提高.由本试验可知,加入YZ无菌滤液仅6h,SOD活性即显著增强,处理72h(3d)酶活进一步增强,而处理288h,藻细胞SOD活性有所下降.胁迫下SOD活性的变化特征随生物的种类、环境因素、胁迫的类型和强度等不同而不同.

传统的叶绿素含量测定时,是将细胞破碎,对叶绿素提取,因为实验提取时操作繁琐,提取时间冗长,叶绿素很容易被破坏[15],从而影响其含量的测定.Phyto-PAM 是利用叶绿素发出的荧光作为信号,从而计算出叶绿素含量.这种方法简单、方便、灵敏、准确.本试验中测得的叶绿素的含量比传统方法测得的含量较高.因此,用 Phyto-PAM测定叶绿素的含量和荧光系数是一种快速,准确分析单细胞藻类的光合作用及生长效率的有效方法.叶绿素荧光技术是以植物体内叶绿素作为探针,是一种快速、灵敏、方便地测量逆境对植物光合作用的理想方法[17].Yield, Pm, α这3个参数都是衡量光合作用强弱的指标[18].与对照组(CK)相比,它们都有明显的下降,说明铜绿微囊藻的光合作用很快受到了抑制,这一抑制来的比藻细胞生长、叶绿素含量的抑制更明显、更迅速.其原因很可能是YZ无菌滤液不仅伤害细胞膜,而且也伤害细胞内的膜系统,如叶绿体的光合膜等.李大辉[19]在研究铅污染对菱幼苗叶细胞亚显微结构的影响时指出叶绿体是植物进行光合作用的场所,当叶绿体膜出现明显破坏和基质类囊体明显空泡化时,意味着叶绿体逐步丧失光合功能.因此,叶绿体膜系统被破坏,直接导致光合作用能力显著降低,其中 Pm下降最显著,电子传递严重受阻,使得光合活性中心无法正常运转[20].

总的来说,溶藻细菌 YZ具有较强的溶解铜绿微囊藻的特征,在短时间内通过破坏藻细胞膜系统的完整性,影响其光合效率,达到比较好的溶藻效果.但仍需要对其溶藻机理的全面深入探讨,尤其是 YZ分泌的溶藻物质的特性和结构确认等仍是一个有待深入研究的重点.

4 结论

4.1 接入的无菌滤液的量与溶藻效果成正比的.试验证明,当100mL中加入10mL的YZ无菌滤液,既能达到最佳溶藻效果,又能排除培养基对试验的干扰.

4.2 YZ无菌滤液主要是通过降低 SOD活性,显著增加膜脂过氧化,抑制铜绿微囊藻光合能力,从而表现对铜绿微囊藻强烈的溶解作用.

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Algicidal effect of an algae-lysing bacterium YZ on Microcystis aeruginosa

. NIU Dan-dan, ZHENG Qing-song, LIU Zhao-pu*, ZHANG Na, WANG Hui, YAO Yao (Jiangsu Provincial Key Laboratory of Marine Biology,College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China). China Environmental Science, 2011,31(2)：321～326

For the sake of further research on Algae-lytic effect of YZ which was isolated from a lake in Qingdao, The algae-lytic influences of different content of YZ bacteria-free filtrate on the growth of M.aeruginosa FACHB469, the content of chlorophyll and malondialdehyde(MDA), superoxide dismutase (SOD) activity, the actual photochemical efficiency of PS Ⅱ in the light (ΦPS Ⅱ =yield), the maximal relative electron transport rate (Pm), light use efficiency (α) in M. aeruginosa FACHB469were studied. In a certain range, the content of YZ bacteria-free filtrateYZ was in direct ratio with the effect of algae-lying. When more than 10mL bacteria-free filtrate was added into 100mL M.aeruginosa, it did not only inhibit the growth of FACHB469significantly, but also caused the MDA contents increased, the activity of SOD was enhanced in 6and 72hours. Besides, the yield, Pm and α were decreased obviously. Algae lysis of YZ was mainly attributed to the decreased activity of SOD, the enhancement in the liqid peroxidation of the cellular membrane and the photosynthetic inhibition of M.aeruginosa.

algae-lysing bacteriaYZ；Microcystis aeruginosa；algae-lysing；chlorophyll fluorescence characteristics

X172

A

1000-6923(2011)02-0321-06

2010-06-04

国家自然科学基金资助项目(30600086)

* 责任作者, 教授, sea@njau.edu.cn

牛丹丹(1984-)女,吉林白城人,南京农业大学海洋生物学省重点实验室硕士研究生,主要从事海洋藻类与海洋微生物研究.发表论文1篇.