生物催化合成1,3-丙二醇工艺的研究

2011-11-02 08:34冷桂华王瑞君孙万里
食品工业科技 2011年12期
关键词:丙二醇克雷伯甘油

冷桂华,王瑞君,孙万里

(宜春学院化学与生物工程学院,江西省天然药物活性成分研究重点实验室,江西宜春336000)

生物催化合成1,3-丙二醇工艺的研究

冷桂华,王瑞君,孙万里

(宜春学院化学与生物工程学院,江西省天然药物活性成分研究重点实验室,江西宜春336000)

以甘油为底物,利用克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇的实验中,考察了初始甘油浓度、温度、pH、通气策略等发酵条件对1,3-PDO产量的影响。实验结果表明:积累1,3-PDO的适合条件为:甘油的初始浓度为40g/L、发酵温度37℃、pH7.0、0.5V/V·min的通气量,发酵30h,反应液中PDO的产量可达57.63g/L。

生物合成,1,3-丙二醇,发酵,工艺

克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae) 由华东理工大学国家化生中心提供;粗甘油 工业级,上海化学试剂采购供应站中心化工厂;酵母浸膏生化级,北京奥博星生物技术有限责任公司;甘油分析纯,天津市福晨化学试剂厂;维生素B12、甘氨酸生化级,上海国药集团化学试剂有限公司;1,3-丙二醇、高碘酸纳 分析纯,上海国药集团化学试剂有限公司;K2HPO4、KH2PO4分析纯,成都科龙化工试剂厂;(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O 分析纯,天津市永大化学试剂开发中心;KOH 化学纯,上海光华化学试剂厂;种子培养基(g/L) 甘油10,葡萄糖4,K2HPO4·3H2O 0.8,KH2PO40.5,(NH4)2SO42,MgSO4·7H2O 0.5,酵母浸膏3,微量元素1mL,Fe2+溶液0.5mL;发酵培养基(g/L) 甘油40,葡萄糖2,K2HPO41.2,KH2PO40.4,(NH4)2SO43,MgSO4·7H2O 0.5,酵母粉1.5,微量元素1mL,铁溶液0.6mL;微量元素成分和铁溶液的配制 参照文献[5]。

DSX-280A不锈钢灭菌器 上海申安医疗器械厂;SPX-250BS-Ⅱ生化培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司;UV-2000紫外分光光度计 尤尼柯仪器有限公司;BIOTECH-7BGZ磁力搅拌发酵罐上海保兴生物设备工程公司;SP-3420A气相色谱仪北京北分瑞利仪器有限公司;BCM-1000A生物洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;BS224S电子分析天平 北京赛多利斯仪器有限公司。

1.2 1,3一丙二醇的发酵培养方法

1.2.1 种子培养 250mL三角瓶棉塞加牛皮纸封口,装液量100mL,接入斜面菌苔1环,在37℃的生化培养箱、转速为150r/min下培养12h。

1.2.2 发酵培养

1.2.2.1 分批发酵 在5L发酵罐中,装入发酵培养基4L,接种量为5%(v/v),搅拌速度200r/min,发酵温度37℃,通气量0.5V/V·min,发酵过程中体系pH用5mol/L的NaOH自动调控为7.0。

1.2.2.2 补料分批发酵 在5L发酵罐中,装入发酵培养基3L,接种量为5%(v/v),搅拌速度200r/min,发酵温度37°C,通气量0.5V/V·min,发酵过程中体系pH用5mol/L的NaOH自动调控为7.0。在初始甘油降到15g/L以下时开始流加底物甘油,保持甘油浓度在15~25g/L范围内。

1.3 分析方法

1.3.1 生物量测定 采用比浊法,以未接种的发酵培养基为对照,分光光度计于650nm处检测细胞的浓度,根据干重与OD650对应的标准曲线计算。

1.3.2 目的产物1,3-丙二醇以及副产物乙酸和乙醇含量的测定 气相色谱法测定,检测器为FID,色谱柱为毛细管柱,柱温130℃,汽化室与检测器的温度均为240℃,载气为N2,进样量0.5μL,采用外标法定量。

1.3.3 甘油、葡萄糖含量测定 分别采用高碘酸氧化法[6]、DNS比色法[7]。

2 结果与分析

2.1 在分批发酵中初始甘油浓度对发酵的影响

利用克雷伯氏菌的PDO发酵中,甘油是发酵底物中的物质基础,提供碳源和能源,其浓度对产物1,3-丙二醇有较大的影响。分别取20、40、60、80g/L的初始甘油浓度进行分批发酵实验,实验结果见图1、图2。

图1 分批发酵过程中不同初始甘油浓度(g/L)下生物量的变化

由图1可知,甘油初始浓度在20~60g/L范围内的菌体生长比较好,菌体生长15h左右基本上处于停滞状态,初始甘油浓度60g/L稍有生长,但增殖较小,发酵30h其菌密度比其它两种情况稍高些。初始甘油浓度为80g/L时,生长相对缓慢得多,菌体密度也偏小。由图2可以看出,初始甘油浓度分别为40g/L和60g/L时,二者的PDO生物合成情况有相似之处,前者比后者更早到达最大产量,且浓度稍高些。初始甘油浓度分别为20g/L和80g/L时,二者的PDO生物合成情况也有相似,相比之下,80g/L时的PDO浓度低了很多。结合图1、图2,初始甘油浓度20g/L,在发酵初期的菌体生长旺盛,可能由于碳源的缺乏影响了PDO的合成。40~60g/L的初始甘油,细胞生长良好,PDO浓度也高,可能由于底物的抑制作用较小。80g/L的初始甘油浓度过高对发酵有抑制作用[8],主要是生成高浓度的3-羟基丙醛,在细胞中积累到一定浓度,会毒害细胞,使发酵终止。综合成本考虑,分批发酵中甘油初始浓度选为40g/L最佳。

图2 分批发酵过程中不同初始甘油浓度(g/L)下1,3-丙二醇含量的变化

2.2 流加补料发酵中温度对1,3-丙二醇生成的影响

温度是影响微生物生长代谢的基本环境因素之一,酶活对温度的变化很敏感,合适的温度将有利于酶促反应,有利于产物的形成。克雷伯氏肺炎杆菌属于肠道细菌,生长温度应该接近人体温度,实验选用34、37、40℃三个温度情况来考察温度对PDO转化的影响,结果如图3所示,由图3可以看出,37℃下的1,3-丙二醇的产量最高,达到57g/L左右。在40℃条件下其1,3-丙二醇的产量很低。在34℃下产物的最高浓度达 38g/L左右,所以温度偏低(34℃)、偏高(40℃)都会影响发酵产物的产生,低温可能影响1,3-丙二醇形成的酶系活力,高温可能对于细胞有极大的破坏,因此37℃为1,3-丙二醇生物合成中的较理想温度。

图3 流加补料发酵中温度对1,3-丙二醇生成的影响

2.3 流加补料发酵中pH对1,3-丙二醇生成的影响

微生物的生长和代谢中,环境的pH对细胞的生长与代谢有着重要影响,同样微生物代谢的活动反过来又会影响环境液的酸碱状态。克雷伯氏肺炎杆菌属于肠道细菌,其生长环境在pH6.5~7.5之间,实验方法采用对比实验,考察pH为6.5、7.0、7.5和不调pH条件下整个发酵过程中PDO的生成情况。

图4表明发酵液的pH在6.5~7.5之间,产物的积累可以延续到25~30h,在pH为7的条件下产量可达到57g/L左右,浓度最大,这与有关报道克雷伯氏肺炎杆菌产生1,3-丙二醇的最适酸碱环境pH为7.0左右相适[9],而不调pH条件下产物的积累只能持续10h,并且产量很低,只有15g/L左右,这与克雷伯氏肺炎杆菌代谢甘油,产生有机酸如乙酸,乳酸等,使pH下降,使菌体的生长代谢也受到抑制有着非常密切的关系。

图4 流加补料发酵中pH对1,3-丙二醇生成的的影响

2.4 通气策略对1,3-丙二醇生成的影响

克雷伯氏肺炎杆菌利用甘油作为底物进行分解代谢时,其代谢途径见文献[10],在好氧情况下,代谢主要经3-磷酸甘油代谢;在厌氧情况下,甘油代谢将主要通过二羟丙酮途径。目前有许多报道关于1,3-丙二醇在有氧参与的情况下发酵的研究,其产量、生产强度等发酵结果要高于厌氧发酵[11]。为此实验设计了三种通气策略来优化发酵条件。Ⅰ:整个发酵过程不通空气;Ⅱ:发酵0~20h通0.5V/V·min空气,20~40h不通空气;Ⅲ:全发酵过程通0.5V/V· min空气。实验结果如图5所示。

图5 流加补料发酵中通气策略对发酵的影响

由图5可见,在第Ⅱ和第Ⅲ通气策略下,其OD650始终大于第Ⅰ情况,而且菌体增殖持续时间更长。三种情况下产物PDO生成量的差别不是很大,Ⅲ在30h积累量最大,接近57g/L,Ⅱ的产量达55.65g/L,不通气情况下最小。考虑到生产成本与操作的方便性,选用全发酵过程通0.5V/V·min空气来发酵生产。

3 结论与讨论

3.1 发酵液中的初始甘油为40g/L,为克雷伯氏肺炎杆菌利用甘油作为底物进行生长代谢提供碳源和能量,代谢中间产物3-羟基丙醛浓度不高,这种有毒的化合物能及时被转化,解除3-羟基丙醛的积累,有利于1,3-丙二醇的合成。

3.2 发酵液的温度维持在37℃下,甘油转化成1,3-丙二醇过程中的三个关键酶-甘油脱氢酶(GDH)、甘油脱水酶(GDHt)和1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)的酶活力达到较佳状态,PDO的产率相对较高。

3.3 发酵过程中pH为7.0的条件下,菌体生长良好,PDO生物合成量最高,有几方面的原因:a.GDHt甘油脱水酶的活性恰好在pH为7.0的时候最高[12],甘油脱水酶为甘油向PDO转化途径的第一个酶,为1,3-丙二醇发酵几个关键酶中的限速酶;b.发酵液中的pH影响着细胞内的氧化还原电位,影响到NADH/NAD的含量,而PDO合成途径与胞内辅酶的氧化、还原状态相关,也就间接影响到PDO的合成; c.pH对克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇过程中的副产物如丁二酸、乳酸、乙酸、乙醇和2,3-丁二醇等有显著影响[13],过多的副产物都会毒害细胞,也抑制产物的形成。

3.4 通气量在0.5V/V·min的微好氧条件对1,3-丙二醇的发酵最有利。氧气的存在会对PDO发酵中几种关键酶的活性产生抑制作用[14],但通入微量的空气,对发酵反而有明显的促进作用。原因可能是前期菌体生长时氧的供应对菌体生长有利;微量氧作为氢受体有利于调节氧化途径和还原途径之间的NAD+/NADH平衡,消除厌氧途径积累的大量NADH。

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Study on the biocatalysis synthetic technique of 1,3-propanediol

LENG Gui-hua,WANG Rui-jun,SUN Wan-li
(Chemical and Biological Engineering College,Yichun University,Key Laboratory of Jiangxi Province for Research on Active Ingredients in Natural Medicines,Yichun 336000,China)

The effects of glycerol concentrations,temperature,pH and aeration strategies were investigated on the production of 1,3-propanediol with glycerol as substrate by Klebsiella pneumoniae.The results showed that the most suitable condition of accumulating 1,3-PDO were glycerol concentrations 40g/L,temperatures37℃,pH7.0 and aeration rate 0.5V/V·min,fermentation time 30h,respectively.The PDO concentration in the fermentation broth reached 57.63g/L.

biosynthesis;1,3-propanediol;fermentation;technique

TS201.1

B

1002-0306(2011)12-0136-04

1,3-丙二醇(1,3-propanediol,简称1,3-PDO)是一种重要的化工原料,可直接用作防冻剂,是增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂的合成原料[1],广泛用于食品、化妆品和制药等行业[2]。目前1,3-丙二醇最主要的用途是作为合成聚酯、聚氨酯的主要原料,聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)是一种新型聚酯材料,具有许多优良特性,主要用于生产纤维和纺织品,是合成纤维新品种开发的热点[3],制约PTT发展的关键因素在于1,3-丙二醇的成本问题。1,3-丙二醇可通过化学法和生物法生产[4],化学法生产消耗了不可再生的有限资源,造成环境污染,同时化学法生产原料及设备要求高,生产存在设备投资大、工艺复杂、条件苛刻和环境污染,且原料石油资源日益匮乏等问题;生物法具有原料可再生、操作简便、反应条件温和、副产物较少、环境污染小等优点,越来越受到人们的重视,各国都致力于研发生物技术合成1,3-丙二醇。本文以甘油为主要底物、以克雷伯氏肺炎杆菌为菌种,探讨发酵生产1,3-丙二醇的条件,以提高1,3-PDO转化率,降低其成本。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

2011-09-01

冷桂华(1968-),女,硕士,副教授,研究方向:食品生物技术。

江西教育厅计划项目资助(GJJ10603)。

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