7种鸭源细菌的分离与16SrDNA测序鉴定

孙化露，陈 冰，李树纯，陈素娟，彭大新

（扬州大学兽医学院 农业部畜禽传染病学重点开放实验室，江苏 扬州225009）

近年来鸭病呈逐渐增加的趋势，其中病毒性疾病包括鸭流感、鸭新城疫、鸭病毒性肝炎、鸭细小病毒病、鸭呼肠孤病毒感染、鸭瘟等；细菌性疾病包括鸭疫里默氏杆菌病、大肠杆菌病、沙门菌病和禽霍乱等，这些病给养鸭业带来了严重的危害。由于一些细菌为条件性致病菌，混合感染或继发感染后会造成更大的损失；加之细菌易产生耐药性，不同细菌之间可能存在耐药基因的传递。因此，有必要对鸭病中可能存在的细菌种类做出鉴定。我们从病死鸭的脏器中分离鉴定出一些细菌，并通过16SrDNA序列分析来确定其种属，探讨了鸭病中可能存在的细菌感染。

1 材料与方法

1.1 试 剂 YEAST EXTRACT、TRYPTONE等，购自英国 OXOID公司；16SrDNA Bacterial Identification PCR Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit，购自TaKaRa公司；pGEM－T Easy载体，购自Promega公司；细菌微量生化反应管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；麦康凯、琼脂粉及其他试剂，购自国药集团。

1.2 病料采集与培养 从病死或濒临死亡鸭子的心、肝、脾、脑等组织进行无菌分离，分别接种于普通LB琼脂、血清LB琼脂（含5%～10%的小牛血清）和麦康凯等培养基，于需氧和厌氧条件（蜡烛培养罐）下，37℃温箱中培养。18～24h记录菌落大小、颜色、形态等。

1.3 染色与镜检 挑取纯化后的单菌落，涂片后进行革兰染色，油镜下观察。

1.4 生化反应 取分离菌的纯培养物接种于微量生化反应管，37℃温箱中培养24h，记录生化反应结果［1］。

1.5 16SrDNA序列分析 采用煮沸裂解法制备细菌基因组DNA模板，取400μL过夜培养的菌液12 000r/min离心10min，沉淀用100μL灭菌超纯水重悬，100℃水浴10min，置于冰上10min，12 000 r/min离心10min，取上清作为PCR模板；根据16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit说明进行PCR扩增，用Agarose Gel DNA Purification Kit回收纯化阳性条带，克隆至pGEM－T Easy载体，鉴定的阳性质粒送南京金斯特科技有限公司进行测序；将测定的序列在NCBI网站进行BLAST搜索比对，鉴定细菌种属，采用MegAlign软件进行菌株同源性分析［2］。

2 结果

2.1 培养及染色特征 共筛选出7株细菌，分别命名为 D1001、D1002、D1003、D1004、D1005、D1006和D1007。其中D1001、D1004和D1007在麦康凯上均为白色湿润菌落，且都可在普通LB上生长良好；D1002在麦康凯和普通LB中均生长良好，在麦康凯上培养的细菌在4℃冰箱放置一段时间后有水溶性淡绿色色素形成，且在普通LB生长的菌落有特殊的生姜气味；D1003需要在血清LB中厌氧培养，在普通LB需氧条件下生长缓慢，4℃冰箱中放置3～4d，细菌极易死亡；D1005和D1006在普通LB严格需氧和严格厌氧条件下生长缓慢。

染色发现，D1001和D1007均为革兰阴性直杆菌，散在或是成对存在；D1002和D1004均为革兰阴性杆菌，形态相似，中等大小，单个或呈短链状；D1003在普通LB中需氧条件下培养24h，涂片染色镜检为革兰阴性、长丝状菌，而在血清LB厌氧条件下培养后染色呈多形性。D1005为革兰阳性菌，球状至杆状不等，形态多样；D1006，涂片染色镜检为革兰阳性球菌、呈四联状或成对排列。

2.2 生化特性 除D1003和D1004的生化特性模式一致外，其他的均有差异（表1）。

表1 分离菌株生化反应特性

2.3 16SrDNA PCR扩增及克隆结果 用16SrDNA试剂盒扩增分离菌的16SrDNA片段后琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下观察，在500bp左右有一条特异条带；克隆至T载体后以EocRⅠ酶切，可见一条3 000bp的载体片段和一条500bp的目的条带（图1）。

图1 分离株D1001 16SrDNA的PCR扩增及T载体克隆

2.4 16SrDNA的序列测定及分析 将7种细菌的16SrDNA序列在NCBI上进行BLAST搜索比对，其与GenBank中最接近细菌的同源性为96.8%～100%，因此可以确定这些细菌分别为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鸭疫里默氏菌、施氏假单胞菌、麦氏棒杆菌、浅绿气球菌和鼠伤寒沙门菌（表2）。其中鼠伤寒沙门菌分离菌与大肠杆菌的同源性为98.4%，铜绿假单胞菌与施氏假单胞菌的同源性为96.4%，7株分离菌的同源性最小为69.4%（图2、图3）。

3 讨论

样本中微生物的分离鉴定通常依赖于各种各样的表型观察，但由于有些表型不典型可能会导致错误的结果。目前出现了许多基于分子生物学技术的快速而直接的检测微生物的方法，其中细菌的16S rDNA序列分析是目前较好的新方法之一，它已经被广泛使用［3］。16SrRNA分子大小适中，有足够的遗传信息用于分类研究［4－5］。16SrRNA基因的系统进化分析还能帮助我们认识新的细菌，通过分析，可以计算出细菌种属间的遗传距离。本次分离的7种细菌分别为沙门菌、大肠杆菌、鸭疫里默氏菌、铜绿假单胞杆菌、施氏假单胞菌、浅绿气球菌和麦氏棒杆菌，与GenBank中最近的细菌菌株的同源性为96.8%～100%，因此可以快速确定细菌的种属。

表2 分离菌16SrDNA基因序列比对鉴定结果

大肠杆菌、沙门菌、鸭疫里默氏菌是感染鸭的常见致病菌，既可与其他病毒性疾病造成混合感染或继发感染，也可单独感染或彼此混合感染，在临床上易引起肝周炎、心包炎和腹膜炎。正常情况下大肠杆菌可在麦康凯上形成红色菌落，极易与沙门菌相区别，但是有些不能发酵乳糖的大肠杆菌则需进一步鉴定才能与沙门菌相区别。鸭疫里默氏菌虽然在含血清的培养基上厌氧条件下生长良好，但也可在LB琼脂平板上生长，其涂片染色镜检呈长丝状的形态具有一定的诊断意义。

铜绿假单胞菌也称绿脓杆菌，广泛分布于自然界、土壤、水、空气，且可以长期存在于人体的体表及腔道中，是临床常见的条件致病菌，能引起人及多种动物（牛、羊、兔、禽类等）［6－8］发病。施氏假单胞菌也是假单胞菌中的一种，它可以利用其他假单胞菌不能利用的某些碳水化合物，且不能产生荧光色素［9］，该菌可引起人的菌血症、骨骼感染（骨折感染、关节炎、脊髓炎等）、心内膜炎、眼部感染、脑膜炎、肺炎、尿道感染等［9］。浅绿气球菌和麦氏棒杆菌也都是条件致病菌，广泛分布于自然界。浅绿气球菌在特定条件下可引起脑膜炎、菌血症、尿道感染等［10］；麦氏棒杆菌在特定条件下也可引起菌血症、泌尿道感染等。这些细菌在人类可条件性地引起感染，但在动物中的致病性还未知。

总之，我们从病死鸭中成功鉴定出7种细菌，其中沙门菌、大肠杆菌、鸭疫里默氏菌为常见的致病菌，而铜绿假单胞杆菌、施氏假单胞菌、浅绿气球菌和麦氏棒杆菌较为少见。虽然部分分离菌对鸭的致病能力还需进一步的研究，但在鸭病控制过程中应注意可能存在一些不常见细菌的混合感染。

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