3个紫花苜蓿品种耐盐突变材料的耐盐性评价

王 珺，柳小妮

(甘肃农业大学草业学院 草业生态系统教育部重点实验室 中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

植物生产层

3个紫花苜蓿品种耐盐突变材料的耐盐性评价

王 珺，柳小妮

(甘肃农业大学草业学院 草业生态系统教育部重点实验室 中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

选取国外耐高温高湿的3个紫花苜蓿(Medicagosativa)品种：“维多利亚”、“盛世”和“CW787”，用NaCl作选择剂，采用一步和多步正筛法，筛选出耐盐愈伤组织变异系，对其再生植株的丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量，以及超氧化物歧化酶活性等生理指标进行了测定，并采用隶属函数法对耐盐突变材料的抗盐性进行了综合评价。结果表明，经筛选得到的耐盐突变材料的丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量以及超氧化物歧化酶活性均显著(P<0.05)高于未经筛选的对照植株，其耐盐性大小依次为：“盛世”>“CW787”>“维多利亚”。

紫花苜蓿；耐盐突变材料；生理生化指标；耐盐性；模糊隶属法

土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的严重问题，我国是世界上主要的盐碱地国家之一，盐碱地面积约4 000万hm2，约占陆地总面积的25%，仅海岸带、滩涂就在667万hm2以上[1]。近年来，环境恶化，淡水资源缺乏导致各地盐碱地增多。紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上栽培利用最广泛的豆科牧草，具有产量高、品质好、各类家畜喜食等优点，被誉为“牧草之王”，筛选具有高耐盐特性的紫花苜蓿新品种，是改良和利用盐碱地的重要途径。

植物耐盐新品种选育方法主要包括引种筛选、杂交、细胞工程和基因工程等。提高作物的耐盐性，最终决定于2个因子：首先是耐盐遗传变异的获得，其次是耐盐胁迫下进行较大强度的选择与筛选[2]。在植物组织培养产生的植物群体中，变异是一种常见的现象。体细胞无性系变异是基因型依赖性的，即随基因型不同，变异的数量和程度也不同。同时其生长过程中培养基里加有不同的激素，对组培的外植体本身就是一种刺激，而且在组培过程中温度和光照时间恒定与自然生长的条件有差异，为变异提供了可能[3]。充分利用植物离体培养过程中存在的广泛的体细胞变异可以很快培育出耐盐突变体材料。

近年来，对苜蓿耐盐性的研究也取得了不少成果，并逐渐应用于生产实践，对一些盐碱地的改良利用作出了重要贡献。如采用NaCl 作为选择压力，通过植物组织培养技术，获得了多种植物的耐盐突变体和耐盐植株[1，4-5]，在紫花苜蓿耐盐转基因方面的研究也有不少报道[6]，而细胞工程技术相关研究获得的耐盐植株，对其耐盐能力大小缺乏较为准确地综合评价，也存在选择的耐盐突变体在抗性、育性、产量、品质等方面的不协调问题[7]。

植物耐盐机制是错综复杂的，耐盐性状是受多基因控制的，涉及多种生理和代谢途径。利用耐盐突变材料生理生化功能上的差别，可为判断耐盐变异体提供一些依据。目前采用生理生化检测研究主要集中在无机离子积累、游离脯氨酸的变化和蛋白质酶的变化等研究方面[8]。本研究选取国外耐高温高湿的3个紫花苜蓿品种，用NaCl作选择剂，采用一步和多步正筛法，筛选培育出耐盐突变材料后，通过对其再生植株的丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量以及超氧化物歧化酶活性的测定，以评价其耐盐性，并采用隶属函数法对其抗盐性进行了综合评价，研究结果对紫花苜蓿耐盐育种和耐盐生理机制研究有一定参考价值。

1 研究材料和方法

1.1试验材料 试验材料为国外3个耐高温高湿的紫花苜蓿品种：“维多利亚(Vitoria)”，“盛世(Millennium)”和“CW787”。 试验种子由北京克劳沃公司提供。

“维多利亚”、“盛世”和“CW787”都喜温暖半湿润气候，具有耐旱、耐高温的特点，且对苜蓿病虫害也有较高的抗性，在中国南方种植较广。“盛世”具较好的耐盐碱特性，“维多利亚”抗高温并且耐严寒，“CW787”的抗逆性强。王媛媛等[9]的研究也证明，Millennium紫花苜蓿种子在NaCl溶液浓度小于175 mmol/L时，种子的发芽率都在90%以上，耐盐性较好。

1.2试验方法

1.2.1耐盐突变材料的筛选与再生 基础培养基为MS，在基本愈伤培养基中加入一定浓度的NaCl作为筛选培养基，采用一步正筛法和多步正筛法2种方法。25 ℃下弱光培养。

一步正筛法：取继代3次以上同一克隆的胚性愈伤组织，分别接种于附加质量分数为1.0%的NaCl的筛选培养基中。1个月后，挑选生长旺盛的胚性愈伤组织，分成2～3 mm的小块，转入同样的筛选培养基中。连续继代5次，获得耐盐愈伤组织变异系。

1.0%的质量分数为植物的临界盐浓度，当<1.0%时,植株生长状况良好，>1.0%时,植株生长呈下降趋势,处于劣势[10-11]，故选择NaCl质量分数1.0%的植株为耐盐突变体。

多步正筛法：取继代3次以上同一克隆的胚性愈伤组织，分别接种于标有不同NaCl质量分数的筛选培养基中，1个月后，挑选生长旺盛的胚性愈伤组织，分成2～3 mm的小块，转入质量分数依次升高的筛选培养基中。筛选培养基的NaCl质量分数梯度为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%。连续继代5次，获得耐盐愈伤组织变异系。

经一步正筛和多步正筛法筛选后，把生长旺盛、稳定的耐盐愈伤组织转入分化培养基中，将获得的分化苗移入加生长素NAA的生根培养基中，当试管苗出现3条长3～5 cm的根时移栽。

1.2.2耐盐指标的测定 将通过耐盐筛选获得材料的再生植株和未经筛选的正常植株(CK)，移栽到花盆中，放置于培养室中，温度为25～28 ℃，待苗恢复正常生长(约4周)时，每天浇50 mL的自来水，1周后测定指标。

丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法[12]；脯氨酸含量测定采用茚三酮比色法；可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法[13]；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝方法测定；超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(NBT)法[14]。

1.2.3综合评价 应用隶属函数值法[15]综合评价耐盐突变材料的抗盐性。采用下列公式计算与抗盐性呈正相关和负相关的指标具体隶属值。

式中，Zij为i种j性状的耐盐隶属值；Xij为i种j性状值；Ximin为i性状中最小值；Ximax为i性状中最大值。将耐盐隶属值进行累加，求得平均抗旱隶属值：

式中，n为指标数隶属值，其值越大表示耐盐性越强。

2 结果与分析

2.1耐盐突变材料的再生 由于经历了一段长时间的盐胁迫筛选，耐盐愈伤组织或细胞系的分化能力严重丧失，导致耐盐系难以分化形成再生植株。即使有少数细胞分化，也往往出现畸形植株，移植入土壤后的成活率和结实率极低[16]。本研究获得的耐盐突变材料的再生小苗经过炼苗，90%的移栽成活(图1)。

通过一步正筛法获得的耐盐(质量分数1.0%的NaCl)突变材料的再生植株分别为：“盛世”紫花苜蓿2株，“维多利亚”紫花苜蓿1株。通过多步正筛法获得耐盐(1.0%的NaCl)的突变植株分别为：“盛世”紫花苜蓿2株，“维多利亚”紫花苜蓿2株，“CW787”仅1株。

2.2耐盐愈伤组织变异系的稳定性 对耐盐愈伤组织突变材料进行回接-反回接鉴定，结果如表1所示。

2种方法筛选出的3个品种的耐盐愈伤组织突变材料回接到基本培养基中，1个月后存活率上升，但显著(P<0.05)低于对照的存活率，说明愈伤组织长期在含盐培养基中受胁迫，其生活力下降。

图1 耐盐突变材料再生植株

%

经过1个周期的继代后，活力开始恢复。将存活的愈伤组织反回接到筛选培养基中，一步正筛法中，愈伤组织存活率略低于一步正筛法筛选5 次(含有1.0%NaCl培养基)的存活率，多步正筛法的愈伤组织存活率低于多步正筛法筛选5 次的存活率，3个品种均有同样的趋势。可见，一步正筛法的愈伤组织耐盐稳定性更高，而多步正筛法则可能产生更多生理适应性更强的的愈伤组织。

2.3耐盐植株突变材料的耐盐生理指标 3个品种耐盐突变材料的MDA含量均高于对照正常植株。其中，“CW787”与“维多利亚”紫花苜蓿耐盐突变材料与对照正常植株的MDA含量差异均极显著(P<0.01)；但“盛世”紫花苜蓿品种耐盐突变材料与对照正常植株之间差异不显著(P>0.05)(表2)。说明“CW787”和“维多利亚”紫花苜蓿比“盛世”紫花苜蓿的耐盐突变材料的膜系统自身调节能力好。

所有品种耐盐突变材料有较高水平的脯氨酸，与对照植株间均存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)差异，其中“维多利亚”紫花苜蓿耐盐突变材料的脯氨酸含量极显著(P<0.01)的高于对照植株(表2)，说明“维多利亚”紫花苜蓿耐盐突变材料的耐盐性较高。

3个品种对照植株的可溶性糖和可溶性蛋白含量均低于耐盐突变材料。其中“CW787”和“维多利亚”紫花苜蓿耐盐突变材料可溶性糖含量与对照间差异极显著(P<0.01)，但可溶性蛋白含量差异不显著(P>0.05)；而“盛世”紫花苜蓿耐盐突变材料可溶性糖含量与对照差异不显著(P>0.05)，可溶性蛋白含量相差较大，差异极显著(P<0.01)(表2)。

盐分条件下，膜系统的变化分成2个阶段：首先，表现为盐分对膜系统的破坏，也反映其对盐分的忍耐程度；然后是植物对膜系统的修复。膜系统的修复与SOD等酶活性的升高是分不开的[17]。3个品种的耐盐突变材料的SOD活性均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照植株(表2)，说明3个紫花苜蓿品种的耐盐突变材料的耐盐性明显优于未经筛选的对照植株。

2.4耐盐性综合评价 隶属函数综合评价值反映了各紫花苜蓿品种间的综合耐盐能力的大小，数值越大表明越耐盐[15]。

耐盐性综合评价结果表明(表3)，3个紫花苜蓿品种耐盐突变材料的耐盐性均优于对照植株，说明耐盐突变材料较正常植株的耐盐性有所提高。其中，“盛世”紫花苜蓿耐盐植株的耐盐性最好，而“CW787”又优于“维多利亚”。而在正常对照植株中，“盛世”紫花苜蓿的耐盐性最差。说明紫花苜蓿通过耐盐突变筛选，植株自身的机理发生较大变化，性状变异明显。

3 讨论与结论

3.1紫花苜蓿耐盐突变材料的筛选 本试验选取NaCl作为选择剂，由于单盐毒害比复盐大，用NaCl筛选出的苜蓿品种将更耐盐，参考相关资料选用NaCl溶液作为筛选耐盐突变材料的培养液[18]。筛选方法有多步选择法和一步选择法。多步选择法是选择剂的浓度从低到高，逐渐增大，周荣仁等[19]就采用这种方法进行烟草(Nicotianatabacum)耐盐变异体的筛选，并认为耐盐性既包含深度的生理适应性，也可能包含某个或某些基因的变异；一步选择法是一次增加选择剂浓度，多次选择的方法，王仑山等[20]用这种方法筛选得到耐盐1.0%的紫花苜蓿耐盐愈伤组织，此方法在提高植株分化率方面有一定的效果。鉴于此，本试验用2种筛选方法筛选紫花苜蓿耐盐突变材料，并将选择得到的耐盐愈伤组织转入无盐培养基中继代2次(2个月)，测定了其的耐盐稳定性。结果表明，3个紫花苜蓿品种在各个继代周期，多步正筛法愈伤组织存活率均高于一步正筛法。回接-反回接鉴定表明，一步正筛法的愈伤组织耐盐稳定性更高。

表2 耐盐突变材料的耐盐指标

注：同指标不同大写字母表示不同品种间或突变材料与CK间差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

表3 抗盐性综合评价

3.2紫花苜蓿耐盐变异材料的耐盐性评价 细胞膜是活细胞和环境之间的界面与屏障，各种不良环境对细胞的影响往往首先作用于生物膜[21]。一般说来盐胁迫处理后，耐盐品种细胞膜系统受损程度小，主要表现在细胞膜透性小。而敏感品种细胞膜系统受损严重，表现为细胞膜透性大[22]。MDA作为脂质过氧化作用的产物，其含量的高低是反映膜脂过氧化作用强弱和质膜破坏程度的重要指标，表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱[23]。孙雷心[24]在试验中发现随着低温时间的加长，植物体内·O2-自由基浓度不断增加，加剧膜脂过氧化，植物本身清除·O2-能力下降，导致MDA含量上升，从而使膜结构与功能遭到破坏。本试验中，3个紫花苜蓿品种的耐盐突变材料的MDA含量都高于对照植株，说明耐盐突变材料的抗逆境生长状况要好于对照植株。

脯氨酸是植物体内有效的渗透调节剂之一，脯氨酸的积累是植物体抵抗渗透胁迫的有效方式之一[25]。大量研究表明，许多植物在盐胁迫下脯氨酸迅速积累。周荣仁等[19]筛选出的烟草耐盐细胞系中，脯氨酸含量比原始型高出10倍，认为这可能是细胞渗透势降低，耐盐能力提高的原因之一。这些结果提供了比较直接的关于脯氨酸与耐盐性相关的证据。本试验结果也表明耐盐突变材料的脯氨酸含量都高于对照植株，说明脯氨酸参与了植物组织对盐胁迫的调节。这与王仑山等[20]报道的即使在无盐压下，耐盐变异体的脯氨酸含量也高出对照数倍的结论一致。

植物为了适应逆境条件，会主动积累一些可溶性糖和蛋白，降低渗透势和冰点，以适应外界环境条件变化。可溶性糖是很多非盐生植物的主要渗透调节剂[26]，它也是合成别的有机溶质的碳架和能量来源，对细胞膜和原生质胶体亦有稳定作用，还可在细胞内无机离子浓度高时起保护酶类的作用[27]。盐胁迫下，植物体内蛋白质含量下降，主要由于盐抑制了蛋白质的合成和蛋白质水解的缘[28]。研究表明，可溶性蛋白与调节植物细胞的渗透势有关，高含量的可溶性蛋白可帮助维持植物细胞较低的渗透势以抵抗逆境带来的胁迫[29]。而SOD普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子·O2-自由基的酶[30]，可以提高植物适应逆境的能力。

从本研究结果中可以看出：紫花苜蓿品种耐盐突变材料的可溶性糖、可溶性蛋白含量都显著高于对照植株，由此说明耐盐突变材料具有一定的耐盐性。而且耐盐突变材料的酶活性也均高于对照植株，高的保护酶活性可有效地减轻膜的损害，缓解盐害，这也是耐盐变异体具有一定耐盐性的重要指标。

但植物的抗逆性不仅是一个受多种因素影响的复杂的数量性状，且不同品种的抗逆机制也不尽相同，从而使得不同品种在逆境条件下对某一具体指标的反应也不尽相同。因而用单一指标难以全面准确地反映植物品种抗逆性的强弱，应用多种指标来综合评价植物对逆境的适应能力[30]。但评价植物抗逆性的指标较多，指标间又存在着一定的相关性，使得它们所提供的植物对逆境反映的信息发生交叉与重叠，且各指标在综合评价时的重要性(权重)也不同，如果直接利用这些指标来综合评价植物的抗逆性则会对结果造成偏差。隶属函数分析提供了一条在多指标测定基础上对材料特性进行综合评价的途径，提高了耐盐性鉴定的可靠性。用隶属函数法对3个紫花苜蓿品种的耐盐性进行综合评价，结果表明为“盛世”紫花苜蓿耐盐突变材料耐盐性最高，“维多利亚”紫花苜蓿耐盐突变材料的耐盐性最小，“CW787”居中。说明利用NaCl作为选择剂，所获得的耐盐突变材料的耐盐性明显提高。

国内外的研究人员经过多年的努力，通过常规育种、耐盐突变选择、细胞工程技术等手段，选育出一些耐盐苜蓿。如由中国农业科学院畜牧研究所育成的耐盐紫花苜蓿新品种“中苜1、2、3号”，已逐渐应用于生产实践。但在南方高温、高湿区，仍主要依赖苜蓿品种进口，而且对大面积的滩涂地的改良利用尚在探索阶段。本研究以国外的3个耐高温、高湿的紫花苜蓿为材料，以NaCl作为选择剂，筛选出的耐盐突变体材料，经再生移植后生长良好，而且其MDA、脯氨酸、可溶性糖和蛋白，以及SOD这些生化物质含量的增加，在盆栽试验阶段，尚未对其生长有不利的影响。

本研究建立的高频率分化实验体系，以及所筛选的具有一定耐盐性的突变体材料，对充分利用盐碱地，保证生态安全有重大作用。下一步的研究重点主要是通过浇盐处理，深入评价耐盐突变材料在盐胁迫下的生理生化指标的变化，同时对耐盐突变材料的耐盐遗传特性进行研究，为耐盐新品系的选择奠定基础。

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Evaluationonsalttolerancetosalt-tolerantvariantmaterialsofthreealfalfavarieties

WANG Jun, LIU Xiao-ni

(College of Pratacultural Science, Key Laboratory of Grassland Ecology System, Ministry of Education, Gansu Agricultural University； U.S. Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability, Gansu Lanzhou 730070, China)

Three foreign alfalfa(Medicagosativa) varieties (Victoria, Millennium, and Cw787) with strong resistance to high temperature and humidity were selected to obtain salt-tolerant callus variants by using sodium chloride (NaCl) as selective reagent via positive selection (direct selection and continuous selection) methods. The physiological indexes, including MDA, proline, soluble protein and soluble sugar content, as well as superoxide dismutase (SOD) activity of regeneration plants of callus variants were measured and these physiological indexes was used to comprehensively evaluate the salt tolerance by Subordinate Function method. The results of this study showed that the MDA, proline, soluble protein and soluble sugar content, as well as superoxide dismutase (SOD) activity of regeneration plants of callus variants were significantly (P<0.05) higher than that of control plants. The order of salt tolerance was Millennium > CW787> Victoria.

alfalfa； salt-tolerant material； physiological and biochemical indexes； salt-resistant； subordinate function method

S551+.703.4；Q945.78

A

1001-0629(2011)01-0079-06

2010-01-25 接受日期：2010-05-14

国家科技支撑计划“优质高产抗逆苜蓿和饲料作物新品种选育项目(2006BAD04A04-01)”

王珺(1985-)，女，甘肃兰州人，在读硕士生，主要从事牧草与草坪草种质资源研究。

E-mail:aminta0627@sina.com

柳小妮 E-mail:liuxn@gsau.edu.cn