熊果苷及其中间体的含量测定

姚小丽，郝 亮，陈秀红

（1.华北制药集团河北华民药业有限公司，河北石家庄 052165；2.石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司，河北石家庄 050051）

熊果苷及其中间体的含量测定

姚小丽1，郝 亮2，陈秀红1

（1.华北制药集团河北华民药业有限公司，河北石家庄 052165；2.石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司，河北石家庄 050051）

由于熊果苷对黑色素合成酶（酪氨酸酶）有很好的抑制效果，对人体肌肤有良好的美白作用，因而在化妆品中得到广泛应用。由于天然提取法工艺复杂，生产成本高，不能大规模生产，人工合成法是熊果苷的主要制备方法。介绍了一种同时测定熊果苷及其中间体的检测方法，指导和优化熊果苷的合成与纯化。

熊果苷；高效液相色谱法；葡萄糖；对苯二酚

熊果苷（arbutin）又名熊果甙、熊果素等，因其最早来源于熊果属植株的叶子而得名，其物理性状为白色针状结晶或粉末。

熊果苷是一个集“绿色”、“安全”和“高效”概念于一体的皮肤美白活性物质。它能够迅速渗入肌肤，有效地抑制皮肤中酪氨酸酶的活性，阻断黑色素的形成，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑。该物质无毒害性、刺激性、致敏性，同时还有润肤、愈创、杀菌和协同抗炎等作用。熊果苷的合成方法主要有天然产物提取法、植物组织培养法、酶转化法和化学合成法，前3种方法由于产率低或者提取步骤复杂等原因在目前状况下不适合工业化生产。现在市场上所供应的熊果苷大多是通过化学合成法生成。熊果苷化学合成的一般步骤是由葡萄糖和氢醌在适当保护后，进行糖苷化反应，然后脱保护而得。葡萄糖一般采用全乙酰保护，氢醌一般是用乙酰基保护其中的一个羟基［1－2］。

1 实验部分

1.1 仪器设备

UltiMate 3000液相色谱系统（美国戴安公司提供），包括：UltiMate 3000 pump（泵）、UltiMate 3000 column compartment（柱温箱）、UltiMate 3000 photodiode array detector（检测器）；RI－101示差检测器（日本Shodex公司提供）；AS2060B超声波清洗器；AB204－S天平（瑞士Mettler Toledo公司提供）。

1.2 试剂

乙腈（色谱纯）；五乙酰基葡萄糖（自制），单乙酰对苯二酚（自制），熊果苷对照品（纯度为98%）；熊果苷样品（自制）。

1.3 正交试验［2－8］

1.3.1 方案1

流动相：甲醇/水/盐酸，色谱柱：Agilent ZOR－BAX Extend－C18（250 mm×4.6 mm，5μm）。设计4因素3水平的正交试验：流速为A；甲醇与水的体积比为B；柱温为C；盐酸浓度为D。按照色谱图的对称因子、分离度、理论塔板数来评定在各个条件下的色谱图，如表1所示。

表1 正交试验方案1Tab.1 Scheme 1 of orthogonal test

1.3.2 方案2

流动相：甲醇/醋酸盐缓冲液/冰乙酸，色谱柱为Agilent ZORBAX Extend－C18（250 mm×4.6 mm，5μm）。设计4因素3水平的正交试验：流速为E；甲醇与醋酸盐缓冲液的体积比为F；柱温为G；p H值为H。按照色谱图的对称因子、分离度、理论塔板数来评定在各个条件下的色谱图，如表2所示。

表2 正交试验方案2Tab.2 Scheme 2 of orthogonal test

1.3.3 方案3

流动相：乙腈/水，色谱柱为Shim－pack Vp－ODS（250 mm×4.6 mm，5μm）。设计3因素3水平的正交试验：流速为L；乙腈与水的体积比为M；柱温为N。按照色谱图的对称因子、分离度、理论塔板数来评定在各个条件下的色谱图，如表3所示。

表3 正交试验方案3Tab.3 Scheme 3 of orthogonal test

按照正交试验的计算方法，结合以上试验数据得到如表4所示的结果。

表4 正交试验分析数据Tab.4 Analysis of orthogonal test data

图1 最佳方案色谱图Fig.1 Optimum chromatogram

根据正交试验所得的数据可以知道方案3中的L2M1N2是最佳方案，其中流动相比例的调节对分离度影响最大，然后是柱温箱的温度和流速。最佳色谱 条 件 为 Shim－pack Vp－ODS（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈/水（体积比为40∶60），流速为1.0 m L/min；柱温30℃；检测波长为268 nm。在上述色谱条件下，各物质都能很好地分离（见图1）。

1.4 方法学考察

1.4.1 线性关系的考察

取各步反应的对照品适量，精密称定，用流动相溶解，配制成不同浓度的溶液，分别取20μL注入高效液相色谱仪，以峰面积（y）对进样量的浓度（c）进行线性回归，五乙酰基葡萄糖的线性方程为

线性考察范围为1.022～5.946 mg/m L；单乙酰对苯二酚的线性方程为

线性考察范围为0.503～2.495 mg/m L；五乙酰基熊果苷的线性方程为

线性考察范围为0.332～2.068 mg/m L；熊果苷的线性方程为

线性考察范围为0.320～2.318 mg/mL，线性关系良好。

1.4.2 分析方法的精密度

在同一天的不同时间进行测定，计算精密度，结果表明熊果苷的RSD值为0.15%（n＝6），五乙酰基葡萄糖RSD值为0.10%（n＝6），单乙酰对苯二酚RSD值为0.21%（n＝6），五乙酰熊果苷 RSD值为0.45%（n＝6）。结果表明精密度良好。

1.4.3 样品及回收率的测定

如表5所示，制备同一浓度各3份样品进样，其中熊果苷回收率平均值为98.98%，RSD值为1.60%（n＝3）；第1步产物回收率平均值为99.21%，RSD值为1.48%（n＝3）；第2步产物回收率平均值为97.31% ，RSD值为0.81%（n＝3）；第3步产物回收率为99.68% ，RSD值为0.68%（n＝3）。

结果表明回收完全，方法可行。

表5 回收率的测定结果Tab.5 Determination results of recovery rate

2 结 语

建立了一种同时测定熊果苷及其中间体的方法，通过对所选方法进行的方法学考察，可以知道此方法能很好地测定各阶段的产物，能为研究各阶段的反应提供准确数据。

［1］姚 斌，陈万生，吴秋业.熊果苷合成新工艺［J］.中国现代应用药学杂志，2005，22（5）：389－390.

［2］张明光，胡立松，王石发.熊果苷的合成方法及其检测研究进展［J］.化工时刊，2006，20（12）：61－64.

［3］黄少嫦，黄百芬，陈青俊，等.应用高效液相色谱法测定化妆品中熊果苷的含量［J］.香料香精化妆品，2001（1）：13－16.

［4］程 鹏，陈梅兰，朱 松.高效液相色谱法测定α－熊果苷、β－熊果苷及烟酰胺［J］.色谱，2010，28（1）：89－92.

［5］邱东方，郭应臣，王宏伟.反相HPLC法测定化妆品中熊果苷的含量［J］.化学研究，2000，11（4）：34－35.

［6］周 峰，卢定强.高效液相色谱法同时测定美白类化妆品中熊果苷和氢醌的含量［J］.南通职业大学学报，2008，22（3）：97－99.

［7］王 亮，尚会建，王丽梅，等.葡糖糖检测方法研究进展［J］.河北工业科技，2010，27（2）：132－135.

［8］常虹飞，杨 震.正交试验法优选超临界CO2流体萃取丹参酮工艺的研究［J］.河北工业科技，2008，25（6）：352－353.

Content determination of arbutin and its intermediate

YAO Xiao－li1，HAO Liang2，CHEN Xiu－hong1
（1.Hebei Huamin Pharmaceutical Company Limited，NCPG，Shijiazhuang Hebei 052165，China；2.Zhongqi Pharmaceutical Technology（Shijiazhuang）Company Limited，CSPC，Shijiazhuang Hebei 050051，China）

Arbutin is widely used as cosmetic additive because of its inhibiting effect on human tyrosinase and excellent skin whitening property.Artificial synthesis becomes the dominant means of producing arbutin because of the complicated procedures and the high cost of extracting from natural plant.A determination method of arbutin and its intermediate is introduced to improve technical conditions of synthesis and purification of arbutin.

arbutin；HPLC；glucose；hydroquinone

TQ460.7＋2

A

1008－1534（2012）04－228－04

2012－02－12；

2012－04－23

王海云

姚小丽（1981－），女，河北藁城人，主要从事药物合成中成品及中间体的检测、方法学验证及药物稳定性考察的研究。