不同时间点GABAA受体α2亚基在神经病理性痛中的表达

连宇，司军强，马克涛，尚媛媛 ，李丽

不同时间点GABAA受体α2亚基在神经病理性痛中的表达

连宇，司军强，马克涛，尚媛媛 ，李丽

（石河子大学医学院／新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子832002）

为探讨慢性坐骨神经压榨性损伤（CCI）模型背根神经节GABAA受体α2亚基在不同时间点（3、7、12 d）表达。采用雄性SD大鼠28只，随机分为4组（n＝7）。A组（假手术组）、B组（CCI术后3 d）、C组（CCI术后7 d）、D组（CCI术后12 d），取L4－L6背根神经节做冰冻切片，用免疫荧光染色方法观察GABAA受体α2亚基表达变化。结果显示，（1）CCI模型鼠热缩足反射潜伏期与假手术组相比显著缩短（P＜0.01）。（2）免疫荧光染色示A组、B组、C组、D组DRG神经元均有GABAA受体α2亚基表达，分布于DRG各种直径神经元细胞膜上。（3）与A组比较，D组L4－L6背根神经节GABAA受体α2亚基受体的表达减少（P＜0.05）；B组、C组变化不明显（P＞0.05）。由此可知，慢性坐骨神经压榨性损伤（CCI）模型背根神经节GABAA受体α2亚基表达下调，提示GABAA受体α2亚基参与了神经病理性痛的发生。

GABAA受体α2亚基；神经病理性痛；背根神经节；免疫荧光

神经病理性痛是由于外周或中枢神经系统的损伤或功能障碍所致，损伤修复后疼痛仍可能长期存在，主要特征是：自发的持续性或多变性疼痛 （自发痛）以及痛觉过敏和／或痛觉超敏［1］。背根神经节（dorsal r oot ganglion，DRG）细胞是躯体感觉的初级传入神经元，在疼痛的发生和维持中起着重要的作用［2］。在神经病理性痛的情况下DRG发生显著的可塑性变化，如神经肽、受体、酶和细胞表面分子的表达都发生了不同程度的上调或是下调［3］。

γ-氨基丁酸 （gamma aminobutyric acid，GABA）作为一种经典的抑制性神经递质已经发现了一百多年，GABA受体可分为 GABAA、GABAB和GABAC，其中GABAA受体属于配体门控离子通道受体，由5个亚基（α、β、γ、s、r）组成，组成 GABAA受体亚基的种类有17个（α1－6、β1－4、γ1－4、s、r1－2），其中的α2亚基构成了GABAA受体的优势组合，即α2β3γ2［4］。神经损伤后GABAA受体会发生积极的自身变构以达到镇痛作用，而这种变构就是通过恢复脊髓内α2、α3亚基功能进行的［5］。本实验主要采用免疫荧光技术观察背根节神经元L4－L6GABAA受体α2亚基表达变化，探讨其在坐骨神经病理性痛过程中发挥的作用，旨在为神经痛的治疗提供更多理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

选用成年雄性SD大鼠28只（新疆医科大学实验动物中心提供，动物质量符合一级标准）体重250～280 g。随机分为4组（n＝7）：A组（假手术组）、B组（CCI术后3 d）、C组（CCI术后7 d）、D组（CCI术后12 d）

1.2 CCI模型制备

大鼠以1%戊巴比妥钠 （30～40 mg／kg）腹腔注射麻醉，无菌条件下手术。下肢背侧部纵向切口，暴露股二头肌，经肌间钝性分离于股骨后找到坐骨神经主干，用铬制羊肠线做间距为1 mm的4道结扎，结扎线以不影响神经外膜的血运为度，然后逐层缝合。假手术组除不做铬制羊肠线结扎外其余方法同上。术后单独饲养，笼底铺有锯末，严格12 h明暗交替光照，给予充足的水源和饲料。

1.3 热板实验

分别在术前1 d、术后1、3、7、12 d对CCI模型大鼠和假手术大鼠行热板实验。将白色手术托盘置于52.5℃恒温水浴锅里，使其温度达到平衡。上置一个顶部敞开的透明有机玻璃罩，构成一个容积为20 c m×20 c m×15 c m＝6000 c m3的透明观测盒。将大鼠置于透明观测盒里，用秒表计时，从大鼠后肢与托盘接触到出现踮脚、回缩、舔足、挣扎计为大鼠热缩足反射潜伏期，作为后肢痛阈的指标。为避免组织损伤，时间不得超过30 s。每次测量5遍，取后三次平均值。所有测试都在上午8：00～11：00时之间进行。

1.4 免疫荧光染色及定量分析

在解剖显微镜下取出大鼠的DRG，4%多聚甲醛室温下固定4-6 h，30% 蔗糖溶液过夜后OCT包埋，连续冰冻切片，片厚5μm。DRG冰冻切片用0.01 mol／L PBS液洗4次，每次5 min，然后在室温下加封闭液，1 h后吸去封闭液并加入山羊多克隆GABAARα2（1∶200，SANTA CRUZ），置于室温24 h，吸去一抗，用0.01 mol／L PBS液洗3次，加入FITC标记兔抗山羊二抗（1∶100，中杉金桥），避光室温下作用1 h，再用0.01 mol／L PBS液洗3次，立即于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

对于激光共聚焦显微镜检测的DRG神经元的定量分析是通过测量其胞膜的荧光灰度水平进行的。每张片子选取5个视野，在每个细胞的胞膜随机选取3个点，测量并比较四组的灰度值。

1.5 统计学处理

用单因素方差分析处理数据，组间比较用t检验。统计学分析通过SPSS进行，所有数据用均数±标准差（¯X±S）表示。P＜0.05为有统计学差异，P＜0.01为差异具有显著性。

2 结果与分析

2.1 行为学表现及热痛敏实验

CCI模型制备成功后观察，无伤口感染征象；无伤侧肢体自噬现象；术侧下肢轻触地面，不持重或轻微持重，行走时跛行。热板实验结果如表1所示，CCI模型组术后第1天出现显著的热缩足反射潜伏期缩短，可持续至术后12 d。假手术组前后热缩足反射潜伏期无差异（P＞0.05）；CCI模型组手术侧热缩足反射潜伏期术前1 d与术后1 d、3 d、7 d、12 d相比有统计学差异，与假手术组比较差异具有显著性（P＜0.01）。

表1 假手术组、CCI术侧3、7、12 d组热缩足反射潜伏期变化Tab.1 Change of Ther mal withdrawal latency（TWL）of different groups¯Χ±S，n＝7

2.2 背根神经节神经元GABAA受体α2亚基的表达

免疫荧光染色如图1所示A组、B组、C组、D组DRG神经元均有GABAA受体α2亚基表达，分布于DRG各种直径神经元细胞膜上，在四组的DRG神经元胞膜上GABAA受体α2亚基阳性信号呈梯度性减弱。用高清晰HP-9001处理软件分析结果如图2所示，A组阳性细胞光密度均值OD＝37.2±5.31（n＝7）；B组 OD＝34.9±5.21（n＝7）；C组 OD＝31.1±3.50（n＝7）；D组OD＝20.2±2.24（n＝7）。与 A组相比，B组、C组 L4－L6DRG的 GABAA受体α2亚基表达无明显变化（P＞0.05），而D组 OD＝20.2±2.24（n＝7）GABAA受体α2亚基表达减少，与 A组相比有统计学差异（P＜0.05）。

图1 免疫荧光染色示假手术组、CCI术侧3、7、12 d组GABAA受体α2亚基表达（20×）Fig.1 Expression of GABAA Rα2 on different ti mes of Sham group，CCI operative side 3，7，12 d groups（20×）

图2 假手术组、CCI术侧3，7，12 d组神经元阳性细胞光密度均值Fig.2 Comparison of mean optical density of positive cells in Sham group，CCI operative side 3，7，12 d groups

3 讨论

在疼痛的基础研究中，既往很多外周神经损伤的模型，如保留性神经损伤模型（spared nerve inj ur y SNI）、脊神经结扎模型 （spinal ner ve ligation SNL）、坐骨神经部分结扎模型（partialligation of the sciatic nerve PLSN）等都是损伤轴突或初级感觉神经元，从而模拟损伤区异位放电而研究疼痛的机制［6］。Bennett等［7］于1988年建立的坐骨神经慢性挤压伤（chr onic constriction injur y，CCI）模型手术操作较简单，创伤小，且可以出现较明显稳定的自发痛、热痛觉过敏和机械性痛觉超敏等类似临床神经痛的症状和体征，在神经痛研究中应用较多。

本实验通过建立大鼠坐骨神经缩窄性损伤模型，应用免疫荧光技术观察该模型中不同时间点背根神经节神经元L4至L6GABAA受体α2亚基表达变化。研究发现，在DRG各种直径的神经元细胞膜上均有GABAA受体α2亚基表达，CCI术后12 d阳性细胞GABAA受体α2亚基半定量光密度值OD＝20.2±2.24，小于假手术组半定量光密度值OD＝37.2±5.31，两者比较有统计学差异（P＜0.05）。CCI术后3、7 d半定量光密度值分别为OD＝34.9±5.21和OD＝31.1±3.50，与假手术组比较无统计学差异（P＞0.05）。结果表明GABAA受体α2亚基确实参与了神经病理性痛。而CCI术后12 d受体表达的变化并没有明显的时间规律性，这可能与外周神经损伤程度有关，神经系统不同部位、不同程度、不同时间的损伤，其GABA受体表达也随着发生变化。并且DRG除了从外周端向脊髓传导痛觉外，已经发现在神经病变的大鼠DRG上GABAA受体的密度和敏感性均被持续的下调［8］。虽然GABAA受体α2亚基表达没有明显的时间依赖性，但运用全细胞膜片钳技术记录CCI模型手术侧、假手术组大鼠背根神经节细胞GABAA受体激活电流，发现CCI模型组大鼠手术侧DRG神经元GABAA受体激活电流幅值显著小于假手术组，提示坐骨神经的慢性压榨性损伤改变了损伤侧的GABAA受体的功能［9］。细胞内微电极记录技术记录到相同浓度的GABA引起DRG神经元的去极化的幅度在神经病理性疼痛模型组大鼠明显小于正常对照组大鼠，表明神经病理性痛时，GABA在初级感觉传入终末产生的突触前抑制作用被减弱，从而易化了伤害性信息（痛觉）的传递［10］。

总之，应用免疫荧光染色的方法证明了GABAA受体α2亚基确实参与了神经病理性痛大鼠痛觉传导并且观察了L4至L6DRG神经元GABAA受体α2亚基的表达特点。除之前所述，初级传入突触前抑制作用的减弱可以是由于突触前膜GABAA受体表达的下调，也可以是突触前膜GABAA受体发生了磷酸化或脱磷酸化，使受体的功能活动降低所致［11］。在神经病理性痛的发生中，众多的胞内信号通路参与了GABAA受体亚基磷酸化，如c A MP、PKA、c GMP／PKC、NO、Ca MK II等。而 GABAA受体的磷酸化或脱磷酸化也是我们今后的研究方向，希望对这一方面的研究，使神经病理性痛的发生发展机制更加明确。

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Expression of GABAAReceptorα2Subunit in Neuropathic Pain at Different Ti me Points

LIAN Yu，SI Junqiang，Ma Ketao，SHANG Yuanyuan，LI Li
（School of Medicine／Key Laborator y of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease of Ministr y of Education，Shihezi University，Shihezi 832002，China）

To investigate the expression of dorsal root ganglia GABAAreceptorα2subunit in sciatic nerve chronic cr ush injury（CCI）model at different ti me points（3、7、12 d）.Methods：Twenty-eight male Sprague Dawley rats were rando mly divided into 4 groups：group A of sham operation，group B 3 days after CCI；group C 7 days after CCI，and group D 12 days after CCI.L4-L6 dorsal root ganglia were used f or frozen sections.Immunofluorescence staining was applied to observe the changes in GABAAreceptorα2subunit.Results：（1）CCI injured side produced significantly ther mal with drawal latency shorter（P＜0.01）.（2）The i mmunofluorescence staining sho w A，B，C and D group of DRG neuron nave GABAAreceptorα2subunit expression，located in the DRG each kind of diameter neuron cell membrane.（3）Compared with group A，the expression of L4-L6 dorsal root ganglia GABAAreceptor variousα2subunit receptor in group D decreased（P＜0.05）；no significant changes in group B and group C（P＞0.05）.Conclusion：The decrease in the expression of GABAAreceptorα2subunit in sciatic ner ve chronic cr ush injury（CCI）model of dorsal root ganglia suggests that GABAA receptorα2subunit has a correlation with neuropathic pain.

GABAARα2；neuropathic pain；dorsal root ganglion；i mmunofluorescence

R338

A

1007-7383（2012）02-0202-04

2011-12-02

新疆兵团青年科技创新基金专项（2010JC33）

连宇（1984-），女，硕士生，专业方向为神经生理和血管生理；e-mail：Lianyu8410891＠sina.com。

李丽，（1976-），女，副教授，从事神经生理和血管生理；e-mail：Lily7588＠163.co m。