兔心肌中次黄嘌呤纯化工艺的优化

宋 艳，王智鼎，李岳飞，邱 岚，姜秀梅，孙德军

(1．吉林大学 再生医学科学研究所 生物技术药物教研室，吉林 长春 130021;2．吉林省辉发制药股份有限公司，吉林 辉南 135100)

兔心肌中次黄嘌呤纯化工艺的优化

宋 艳1，王智鼎1，李岳飞1，邱 岚2，姜秀梅2，孙德军1

(1．吉林大学 再生医学科学研究所 生物技术药物教研室，吉林 长春 130021;2．吉林省辉发制药股份有限公司，吉林 辉南 135100)

目的 探索从兔心肌中提取次黄嘌呤的最佳工艺。方法 比较三氟乙酸法、酶解法、酸碱法和醇沉法提取的次黄嘌呤的产率和纯度，得到优化制备工艺。结果 利用醇沉法，向细胞充分破碎后的匀浆液中加入4倍体积的纯水，超声提取，向提取液中加入乙醇至浓度60%，置60℃水浴反应120 min，提取的次黄嘌呤产率为0．83 mg/g，纯度为82．4%。结论 经过纯化工艺比较，醇沉法提取的次黄嘌呤的含量和纯度优于其他方法。

次黄嘌呤;纯化;工艺;优化

次黄嘌呤(Hypoxanthine)又称6-羟基嘌呤，分子式:C5H4N4O，相对分子质量为136．11，针状结晶，易溶于稀酸和碱，水中溶解度约为1．4 mg/mL(100℃)，熔点＞360℃;次黄嘌呤是一种非常重要的生物嘌呤碱，具有降低血压、平喘、治疗痛风等药理活性，在人体内分布广泛，能够参与调节人体内的一些重要生理机能，还可用于治疗各种原因所致的白细胞减少症、血小板减少症等疾病。

肌氨肽苷由哺乳动物心肌和骨骼肌中提取的次黄嘌呤和多肽组成，但现今许多企业应用到肌氨肽苷生产中的次黄嘌呤，无法生物制备得到，而主要采用添加化学品次黄嘌呤的方式来解决。国内已有从动物组织中提取次黄嘌呤的报道［1-3］，但还未见从兔心中提取次黄嘌呤的相关报道。

本文主要研究了从家兔的心肌组织中提取次黄嘌呤的工艺，并比较它们之间的优缺点，从而选择产率高、纯度好的工艺用于次黄嘌呤的生产。

1 材料

家兔均为大型饲养场圈养，饲养方式主要以食草为主，辅以饲料，屠宰后迅速采集新鲜兔心，弃去脂肪含量高的兔心，选取颜色呈暗红色，大小适宜的优质兔心料。

木瓜蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司;次黄嘌呤对照品(批号:140661-200402)，中国药品生物制品检定所。

LC-100型液相色谱仪(包括LC-UV100紫外可见光检测器、G1313AALS自动进样系统、LC-P100高压恒流泵)，WUFENG公司;TDL-40B型台式离心机，上海安亭科学仪器厂;UV-4802型紫外可见分光光度计，Unico公司。

2 方法

2．1 样品处理

取新鲜兔心，去除结缔组织和脂肪组织，绞肉机破碎后，称重，加入一定量的水匀浆，收集匀浆液，180 Hz超声波提取30 min，得混悬液。将混悬液在4℃、4 000 r/min离心30 min，取上清，用无纺布粗过滤。将上清液平均分成4份，每份重0．10 kg，体积100 mL。

2．2 提取方法

2．2．1 三氯乙酸法 取上清液100 mL，加水至200 mL，按体积比的0．05%加入三氯乙酸，边加边搅拌，溶液变浑浊，放置20 min，4℃，3 800 r/min离心20 min，取上清液检测黄嘌呤的纯度及产率。

2．2．2 酶解法 取上清液100 mL，加热煮沸，煎煮15 min后，放置降温至60℃，按质量比0．02%加入木瓜蛋白酶，置于60℃水浴保温3 h，每30 min搅拌一次，3 h后，3 800 r/min离心15 min，取离心液检测次黄嘌呤的纯度及产率。

2．2．3 酸碱法 取上清液100 mL，用10%HCl溶液调节pH值至3．5，加热煮沸，煎煮15 min，室温放置1 h，冷冻过夜，微热解冻，用硅藻土过滤，得滤液。用10%NaOH溶液调节滤液pH值至8．5，加热煮沸，煎煮15 min，常温放置过夜，将分层的组织液用硅藻土过滤，得滤液。用10%HCl溶液调节滤液pH值为7．0。检测次黄嘌呤的纯度及产率。

2．2．4 醇沉法 取上清液100 mL，加入乙醇至终浓度为60%，60℃恒温水浴反应2 h，3 800 r/min离心15 min，取上清液检测次黄嘌呤的纯度及产率。

2．3 样品含量和纯度的测定

采用高效液相色谱法(HPLC)测定次黄嘌呤的纯度和产率。色谱柱为迪马公司C18柱(150 mm×4．6 mm)，柱温30 ℃，进样量为 20 μL，检测波长为250 nm，流动相为0．1 mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH 5．6)，流速为 0．5 mL/min，洗脱时间设定为 20 min，采用外标法计算次黄嘌呤的含量并换算成产率，采用次黄嘌呤峰面积与总面积的比值计算纯度。

3 结果

3．1 不同提取方法的比较

HPLC检测结果表明，不同的提取方法得到的次黄嘌呤的产率和纯度差异较大，醇沉法的含量和纯度较好，结果见表1。

表1 不同的提取方法得到的次黄嘌呤含量和纯度的结果

3．2 醇沉法的优化研究

3．2．1 兔心肌匀浆液加水量的研究 向匀浆液中加入水，加水量从1～5倍体积，加入适量的乙醇液，恒温反应一段时间，3 800 r/min离心15 min，分别取上清液检测次黄嘌呤的含量。次黄嘌呤的产率分别为0．65，0．68，0．74，0．83 和0．84 mg/g，当加入水的体积是匀浆液体积的的4倍时，次黄嘌呤产率较高，加水量的继续增加，溶液中次黄嘌呤的产率略微升高，从生产操作方面考虑，兔心肌匀浆液中加水的量确定为4倍。

3．2．2 兔心肌匀浆液乙醇加入量的研究 在反应温度、促进次黄嘌呤溶解所需水量、保温时间等其他条件不变的情况下，向匀浆液中梯度加入乙醇，使乙醇的终浓度为50%，60%，70%和80%，恒温反应一段时间，3 800 r/min离心15 min，分别取上清液检测次黄嘌呤的含量。次黄嘌呤的产率分别为0．68，0．83，0．83和 0．84 mg/g。结果表明，较低的乙醇浓度不能够使次黄嘌呤有效的释放出来，当乙醇的浓度为60%时，溶液中次黄嘌呤的含量达到较高值，乙醇浓度的继续增加，次黄嘌呤的产率增加并不明显，从经济方面考虑，确定乙醇的终浓度为60%。

3．2．3 反应温度的研究 向兔心组织液中加入一定浓度的乙醇溶液后，加热处理，对反应的温度进行了探索，分别设定反应温度为40，60，80和100℃，保温一段时间，3 800 r/min离心15 min，分别取上清液检测次黄嘌呤的含量。次黄嘌呤的产率分别为0．55，0．83，0．84 和 0．84 mg/g。结果表明，当温度为60℃时，次黄嘌呤的含量达到较高值，继续升高温度，次黄嘌呤的产率升高并不明显，从经济和操作方面考虑，反应温度设置为60℃。

3．2．4 保温时间的研究 对滤液加入一定浓度的乙醇溶液后，加热处理，对保温时间进行了研究，保温时间分别设为 0，60，90，120 和 150 min，3 800 r/min离心15 min，分别取上清液检测次黄嘌呤的含量。次黄嘌呤的产率分别为0．23，0．55 ，0．67，0．83和0．84 mg/g。结果表明，随着保温时间的延长，次黄嘌呤的产率显著增加，时间为120 min，次黄嘌呤的产率达到较大值，120 min后，次黄嘌呤的产率无明显变化，从生产操作和经济方面考虑，把保温时间设定为120 min。

4 讨论

取加入4倍体积水匀浆的兔心组织液上清液100 mL，加入乙醇至终浓度为60%，60℃恒温水浴，反应2 h，3 800 r/min离心15 min，取上清液检测次黄嘌呤的纯度为82．4%，含量为0．83 mg/g。

从兔心肌中提取次黄嘌呤的过程中，得到能最大限度提取次黄嘌呤的控制点，即在细胞充分的破碎后次黄嘌呤完全释放，再在绞碎后的组织匀浆液中加入4倍体积的纯水，乙醇的浓度控制在60%，60℃水浴120 min，次黄嘌呤的产率最高，较报道的从其他动物组织中提取次黄嘌呤的方法简便，可操作性强，是一种适于工业化生产的新工艺。

［1］ 王梦月，韦竟斐，史海明，等．HPLC法测定海龙中胸腺嘧啶、次黄嘌呤、尿嘧啶的含量［J］．中国中药杂志，2010，35(17):2277-2280．

［2］ 王翠丽，王 永，徐亚欧，等．山羊、藏系绵羊和黄牛肉中次黄嘌呤核苷酸含量比较［J］．湖北农业科学，2010，49(11):2860-2863．

［3］ 周 冉，李淑芬．RP-HPLC同时快速测定鹿茸中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷含量［J］．药物分析杂志，2009，29(4):575-578．

Optimization of rabbit myocardial hypoxanthine purification process

SONG Yan1，WANG Zhi-ding1，LI Yue-fei1，QIU Lan2，JIANG Xiu-mei2，SUN De-jun1
(1．Department of Biomedicine，Institute of Frontier Medical Sciences，Jilin University，Changchun 130021，China;2．Huifa Pharmaceutial Co．，Ltd．，Jilin Province，Huinan 135100，China)

Purpose To investigate the content of the different extraction methods of preparation of rabbit myocardial tissue fluid hypoxanthine，to determine the hypoxanthine optimal purification process．Methods Determination of the Trifluoroacetic acid method，enzymatic，ethanol and acid-base extraction hypoxanthine content and purity．Results The tissue fluid too the cells fully broken in four times the volume of pure water，adding ethanol to a concentration of 60%water bath at 60 ℃ for 2 h，extracted hypoxanthine content of 1．410 mg/mL．Conclusion The purification process，compared to the content and purity of the alcohol precipitation extracted hypoxanthine is superior to other methods．

hypoxanthine;purification;process;optimization

TQ464．5

A

1005-1678(2012)06-0839-03

2012-07-20

国家高技术研究发展计划(863)(2006AA020503)

宋 艳，女，硕士研究生;孙德军，通信作者，Tel:0431-85619233，E-mail:sundjjl@yahoo．com．cn。