一株拟南芥镉敏感突变体的筛选及表型分析

裴雁曦，龚泽华，李亚伟，乔增杰，穆遥

（山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006）

一株拟南芥镉敏感突变体的筛选及表型分析

裴雁曦，龚泽华，李亚伟，乔增杰，穆遥

（山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006）

利用不同浓度梯度的CdCl2对拟南芥Col-0生态型进行处理，确定了筛选镉敏感突变体的适合浓度为90 μmol／L.以镉对幼苗根长生长抑制程度为指标，对拟南芥化学诱导激活标签（XVE）T-DNA插入突变体库种子进行筛选.首先在不含有雌激素的1／2 MS培养基进行大规模筛选，挑选根长抑制明显的植株，单株收取种子.在T3代复筛过程中用含有浓度为90μmol／L CdCl2的1／2 MS固体培养基筛选到一株敏感突变体csr-2.并进行了雌二醇诱导过表达表型验证.运用TAIL-PCR技术确定该植株的T-DNA插入位点位于At2g36130，并对该基因的序列进行了初步的生物信息学分析.

拟南芥;突变体筛选;T-DNA插入突变体;镉

随着工业化的迅速发展，人类赖以生存的土壤受到重金属的严重危害，威胁人类健康.重金属污染已经成为全球面临的环境问题［1］.镉（Cd）是生物毒性最强的重金属元素，居五种重金属Cd、Hg、Pb、Cr、As污染之首［2］，作为一种非必须元素，即使在低浓度下也会对植物根的生长造成影响［3］.镉污染周期长、移动快、毒性高、难降解，被镉污染的土壤会对植物生长发育、膜系统、根系、光合作用造成伤害［4］.因此研究镉污染是当下急需解决的环境问题之一［5］.

拟南芥（Arabidopsisthaliana）作为一种基因组背景清晰的模式生物，具备生长周期短，基因组小等优点，是非常方便的基因功能研究材料［6］.

雌激素激活标签（XVE）系统是一种严格依赖于雌激素作为诱导的激活系统，可通过雌激素的用量严格控制下游基因的表达水平，并产生显性功能获得型突变，从而克服了不能筛选鉴定植物生长发育中的关键基因和一些功能冗余基因的问题［7］，这些特点使得其成为筛选突变体有力工具.此外，T-DNA在拟南芥、水稻基因组中的插入方式已被证实，其插入位点是随机的，而且整合的拷贝数较低，被插入的基因在后代中能够稳定遗传［8］.在拟南芥中已经建立了接近饱和的T-DNA插入突变体库［9］.该突变体库具有可被特异诱导物高度诱导、特异激活目标基因［10］的特点.利用这一系统构建的拟南芥突变体库在大规模筛选鉴定功能缺失性和功能获得性突变体的研究中优势明显，目前已经利用该系统得到盐耐受［11］、草酸敏感等相关突变体［12］.

国内外关于植物对Cd的响应及其调控机理均围绕Cd诱导植物抗氧化系统、硫代谢和Cd跨膜转运开展研究，分子机制方面的研究有待进一步深入.本实验室使用XVE系统T-DNA插入突变体库进行了大规模筛选，并获得了大量Cd响应突变体.希望通过对拟南芥镉敏感突变体的筛选和分析，得到与其相关的突变基因，以期进一步了解高等植物中Cd响应的分子机制.本文就其中一株Cd敏感突变体的筛选和鉴定进行研究.

1 材料和方法

1.1 实验材料和培养条件

以拟南芥Col-0生态型、XVE拟南芥突变体库为材料（由中国科学院遗传发育所提供）.23℃、100μmol·m－2·s－1光照、16 h光照／8 h黑暗的光周期条件下培养.

1.2 筛选浓度的确定

先将野生型和突变体种子于4℃黑暗条件下春化3 d，70%乙醇消毒40 s，再用质量浓度5%次氯酸钠处理5～7 min，无菌水漂洗3次，播种于CdCl2浓度梯度为0、30、60、90、120、150μmol／L的1／2 MS培养基中.两周后，观察不同镉浓度对植株根生长的影响情况，确定筛选敏感突变体的适合浓度.

1.3 突变体的筛选

突变体库种子表面灭菌后，播种于含有CdCl2的1／2 MS固体培养基.两周后，挑选根长受到明显抑制的候选敏感突变体，移入无Cd的1／2 MS固体培养基中继续培养5 d后再移入土中，单株采种.将T3代种子按株系分别播种在1／2 MS、含Cd Cl2的1／2 MS、含雌二醇和CdCl2的1／2 MS固体培养基进一步验证表型.

1.4 T-DNA插入位点鉴定

2 结果与分析

2.1 筛选浓度的确定

用不同浓度的CdCl2处理样品，筛选结果（图1）表明，14 d后，与对照植株相比，Cd浓度为90μmol／L时植株根长受到了一定程度的抑制，而浓度为120μmol／L时根长生长受到完全抑制，因此，确定90μmol／L为Cd敏感突变体的适合筛选浓度.

图1 野生型Col-0在不同镉浓度梯度下根的生长情况Fig.1 Growth situation status of Col-0 in MS media with different concentration of Cd2＋

2.2 镉敏感突变体的筛选

将突变体种子播于含有90μmol／L Cd Cl2的1／2 MS固体培养基进行筛选.以14 d后的根长作为初筛标准.初筛共选出约11株有镉敏感表型的突变体，两周之后移栽到土里，单株采种.为避免假阳性，以相同方法对每个株系进行复筛，获得3株表型稳定的突变体，分别命名为csr-1、csr-2、csr-3.为确认这些突变体的敏感表型是T-DNA的插入所致，将csr-1、csr-2、csr-3单株收取的种子分别播种在含有90μmol／L CdCl2的1／2 MS固体培养基和同时含有雌激素以及90μmol／L CdCl2的1／2 MS固体培养基，以野生型为对照.结果表明，与野生型植株生长情况相比，只有csr-2植株的敏感表型会被雌激素的诱导完全恢复最终确认csr-2植株是一株纯和的镉敏感T-DNA插入突变体，其表型数据如图2（P402）所示，野生型和突变体在含有90 μmol／L Cd Cl2的1／2 MS培养基中根长分别为1.5 cm和0.5 cm，而加入雌激素后突变体csr-2根长恢复至1.4 cm，与野生型根长相比几乎没有变化.

图2 突变体csr-2在Cd胁迫下的表型分析（用90μmol／L CdCl2 以及90μmol／L CdCl2＋雌激素处理csr-2，观察突变体生长情况及测量其根长，以90μmol／L CdCl2处理WT作为对照）Fig.2 Phenotype analysis of csr-2 with Cd treatment.Growth status and root length of csr-2 was determined in the condition of 90μmol／L Cd2＋ with estrogen or not.WT treated with 90 Cd as control.Values are means±SE（n＝10）.Values with＊indicate significant differences（P＜0.05）among them

2.3 csr-2插入位点分析和鉴定

对csr-2突变体进行TAIL-PCR分析（图3a，P403），将所获得的片段回收后克隆于p MD18-T载体酶切验证（图3b）后进行测序.序列结果如下：

其中波浪线代表T载体，直线代表T-DNA区，无标记表示拟南芥DNA序列.

NCBI（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi ）Blast比对表明：该突变体的T-DNA插入位点为At2g36130第六个外显子上，位于该基因的1 432 bp和1 583 bp之间（图4a，P403）.数据库查询显示尚无该基因与重金属响应关系的报道.将突变体和野生型中该基因的表达情况进行RT-PCR分析，结果显示该基因表达量在突变体中显著下调（图4b）.

3 讨论

亲环蛋白（cyclophilin，CyP）家族属于具有催化含脯氨酸的寡肽底物顺反异构作用的肽脯氨酰顺反异构酶（peptidyl-prolyl cis-trans isomerases，PPIase）［14］，是一类广泛存在于原核和真核生物体内，并在结构上高度保守的多功能蛋白质.有研究报道，亲环素能够参与植物的胁迫应答反应，马铃薯亲环素作为催化肽脯氨酸顺反异构酶参与了许多胁迫作用的防卫反应［15］.亲环素还能调节蛋白磷酸酶2A的活性，从而调节细胞循环、蛋白质缺乏、反转录、生长和发育的许多信号途径［16］.此外，亲环素具有多种生物学功能，其中2种研究得最为透彻.一种是与Cs A结合形成Cy P-Cs A复合体，在人体中通过钙调磷酸酶抑制免疫反应;另外一种是具有肽酰脯氨酸顺／反异构酶（PPIase）活性，能够催化蛋白质特别是富含脯氨酸的蛋白质折叠，同时起着分子伴侣的作用［17］.

图3 csr-2突变体的Tail-PCR与酶切鉴定（a）第1泳道为第一次PCR产物，2为第二次PCR产物，3为第三次PCR产物且箭头所指为目的条带（b）目的条带与T载体连接后的重组质粒酶切验证（Bam H I和HindⅢ）Fig.3 （a）Tail-PCR to amplify the T-DNA franking sequence of mutant csr-2.Lane 1：first product;Lane 2：secondary product;Lane 3：tertiary product;the arrowhead indicate the target sequences.（b）Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion（Bam H I和 Hind Ⅲ）

图4（a） T-DNA的插入位点及（b）RT-PCR分析突变体基因表达量矩形代表外显子，直线代表内含子Fig.4 （a）Schematic representation of T-DNA insertion site in the mutant.The lines represent introns and rectangles represent exons，respectively.The position of the T-DNA insertion in At2g36130 is indicated by a triangle（not to scale）.（b）RT-PCR analysis of expression of At2g36130 transcripts in wild type（WT）and csr-2

NCBI数据库blast结果显示，At2g36130基因编码肽酰脯氨酰顺反式异构酶，因此属于cyclophilins family（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi ）.相关文献报道拟南芥中肽酰脯氨酰顺反式异构酶包含4个结构上区分的家族：亲环素家族（cyclophilins），FK506结合蛋白家族（FK506-binding proteins），微小菌素家族（parvulins），和蛋白磷酸酶2A催化家族（PP2A phosphatase activator）［18］.该酶能够将以脯氨酸开头的肽链由顺式结构转变成反式结构，这种构象变化降低了蛋白质折叠所需的能量［19］，而且此过程对于蛋白质正确折叠意义重大.利用Protparam tool软件（http：／／web.expasy.org／cgi-bin／protparam／protparam）对其翻译的蛋白理化性质进行分析得知：相关蛋白总共含有164个氨基酸，分子式为C801H1268N230O243S7，分子质量为18 232.6.其二级结构各主要组分所占比例为：Helix＝12.2%，Strand＝31.1%，Loop＝56.7%，而且现有的预测结果表明植物中与其相关的蛋白质存在于叶绿体中的可能性较大（https：／／www.predictprotein.org／get＿results.php？req＿id＝284880）.

目前关于亲环素家族成员与植物重金属胁迫响应的关系还少见报道.对于scr-2突变体生理生化及分子机制的研究正在进行中.

致谢：衷心感谢中国科学院遗传与发育生物学研究所左健儒研究员提供拟南芥突变体库.

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Isolation and Phenotype Analysis of A Cd Sensitive Mutant ofArabidopsisthaliana

PEI Yan-xi，GONG Ze-hua，LI Ya-wei，QIAO Zeng－jie，MU Yao
（SchoolofLifeScience，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China）

We determined 90μmol／L CdCl2as concentration of screening Cd-sensitive mutant by a concentration gradient assay with Arabidopsis thaliana Col-0.According to the effect of Cd2＋on root growth，seeds from an Arabidopsis mutant library which is characteristic by XVE system were screened.In the process of screening，mutants were firstly screened in 1／2 MS without estrogen，and then the seeds of mutant with better root growth were collected individually.In the second screening of T3，the mutant namedcsr-2 was identified by the measure of treating with 90μmol／L Cd2＋，and validated by over-expression induce of estrogen.Finally，the insertion site ofcsr-2 was located at At2g36130 by ail-PCR，and bioinformatics analysis of the gene sequences was conducted initially.

Arabidopsisthaliana;mutant isolation;T-DNA insertion mutant;Cd

O943

A

0253-2395（2012）02-0400-05＊

2012-01- 11;

2012-03-06

回国留学人员项目（2011-007）;教育部博士点（博导类）项目（20091401110004）;高等学校优秀青年学术带头人支持计划（TYAL）

裴雁曦（1970－），男，山西浑源人，博士，教授，主要研究方向为植物分子遗传学.E-mail：peiyanxi＠sxu.edu.cn