泰安市外来婚嫁女HIV亚型分析

侯佩强 杨冬芳 张荣强 王娟娟 牟福生 杨会利

(泰安市疾病预防控制中心，山东 泰安 271000)

2006年以来，随着泰安市外来婚嫁女等人群专题调查工作的深入开展，全市疫情呈现了较快增长的势头，从2004年报告首例外来婚嫁女感染者到2010年底，其感染人数已占全市疫情总数的15.75%，成为全市艾滋病感染率较高的人群之一，其中8名外来婚嫁女的丈夫感染了HIV，3例发生了母婴垂直传播，给感染者家庭和群众健康造成了严重的危害，外来婚嫁女及其配偶子女感染已成为我市近年来艾滋病疫情快速增长的主要原因之一。根据本地的疫情状况，我们采用RT-PCR的方法，测定了泰安市部分外来婚嫁女gag和env基因序列，比较本地区HIV在不同个体和亚型之间的基因变异性，探讨其流行病学特点，为采取针对性的预防和控制措施提供依据。

1 材料和方法

1.1样本来源 HIV抗体确认阳性，并能够随防到的泰安市外来婚嫁女HIV感染者/病人的抗凝全血或血清样本。

1.2前病毒DNA提取

用淋巴细胞分离液分离样品的单核细胞(PBMC)，PBS洗两遍后，使用Qiagen公司的QIAamp Blood Mini Kit试剂盒提取单个核细胞中前病毒DNA，利用promega的逆转录试剂盒进行cDNA合成。

1.3套式聚合酶链反应(PCR)扩增

引物由大连宝生物公司合成。用多对引物进行HIV-1env基因和gag基因片段的扩增，其中，gag基因的引物为GAG-L：TCGACGCAGGACTCGGCTTGC，GAG-E2：TCCAACAGCCCTTTTTCCTAGG；GUX：AGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTC，GDX：GGCTAGTTCCTCCTACTCCCTGACAT。Env基因的引物为ED5：ATGGGATCAAAGCCTAAAGCCATGTG，ED12：AGTGCTTCCTGCTGCTCCCA；Env7：CTGTTAAATGGCAGTCTAGC，Env8：CACTTCTCCAATTGTCCCTCA。

Env基因扩增，第一轮反应条件：以ED5/ED12为外侧扩增引物进行第1轮PCR反应，条件为：50 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，1 个循环；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30～35 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保温。以E7/E8为内侧引物进行第2轮PCR扩增，条件为：94 ℃ 2 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，1个循环；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30～35 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保温。

Gag基因扩增，第一轮反应为RT-PCR，反应条件为：50 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，1个循环；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30～35 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保温;第二轮PCR反应条件为： 94 ℃ 2 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，1 个循环；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30～35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。

1.4PCR产物的纯化和回收

依据QIAquick Gel extraction kit 试剂盒进行，回收的样品DNA应经电泳无明显脱位、杂带，取5 μl PCR回收产物经1%琼脂糖100V电泳30 min，与标准分子量(Marker)比较，初步判断样品的浓度和质量。用2%琼脂糖凝胶电泳浓缩后，切下特异扩增条带进行纯化、回收，再用1%凝胶电泳检测其浓度和纯度。

1.5DNA序列测定

将纯化后的PCR 产物送南京金斯特公司进行测序，使用仪器为ABI 3730测序仪。

1.6序列分析

使用BioEdit软件进行序列比对，然后使用MEGA 4.1软件绘制系统进化树。

2 结 果

2.1基因的亚型鉴定及系统进化树分析

HIV-1分型主要依据env区基因序列并结合gag区基因序列，与HIV-1各个亚型国际参考株比较，通过系统进化分析，最后确定HIV-1病毒基因亚型[1]。T25，T26，T27，T29，T31样本来源为泰安市外来婚嫁女。 gag区基因型分别为01AE(T26，T27，T29)，07BC(T25)和08BC(T31)；env区基因型分别为01AE(T26，T27，T29)，C(T25，T31)。因此5份泰安市外来婚嫁女样本分属于HIV-1型M组的三个亚型，其中3份CRF01-AE重组亚型(T26，T27，T29)，1份CRF07-BC(T25)和1份CRF08-BC(T31)。

图1 泰安市HIV-1 gag基因系统进化树

图2 泰安市HIV-1 env基因系统进化树

2.2基因离散率分析

见表1，各亚型env基因的组内基因距离及与国际参考株的基因距离均大于gag基因。

表1 不同基因区段不同亚型基因距离

3 讨 论

HIV-1基因组主要由gag、env和pol这三个结构基因以及其他调控基因所构成，p24蛋白是由gag基因编码产生的衣壳蛋白，是病毒的重要组成部分，同时其表面具有多个抗体结合位点，在免疫机制中也发挥重要作用，p24蛋白的编码区高度保守，其表位序列的变化可能导致免疫逃避。env基因主要编码产生包膜蛋白、跨膜蛋白等多种糖蛋白，序列变异性较大，其编码的氨基酸差异可达30%，因此env基因的序列通常被作为确定亚型的重要依据[2]。pol基因主要编码产生逆转录酶、蛋白酶等各种酶类，也是抗逆转录病毒药物作用的主要靶位。

2001-2003年进行的第二次全国 HIV 分子流行病学调查，共发现 A、B(占2.55%)、B’(占29.11%)、C(占1.03%)、CRF-BC( CRF07- BC、CRF08- BC)、CRF01-AE(15.54%)和CRF02-AG8种类型HIV-1基因亚型，B’亚型还是分布最广泛的 HIV-1亚型；CRF-BC(CRF07-BC和CRF08- BC)是我国HIV-1重组的主要模式,流行于全国大部分地区[3]; 通过对扩增成功的5样品进行基因亚型鉴定, 发现外来婚嫁女感染者所携带的HIV-1毒株为CRF01-AE、CRF07-BC和CRF08-BC三个重组株，其中3例CRF01-AE重组亚型，1例CRF07-BC重组亚型和1例CRF08-BC重组亚型。泰国的研究显示，CRF01-AE比泰国B亚型病毒更容易传播，而且死亡时间比西方国家提前[4]。一项在中国南方四省(广西、广东、江西和湖南)的HIV分子流行病学调查显示，CRF01-AE流行毒株在人群中所占比例较多，是优势传播毒株，并且和越南CRF01-AE有较高的同源性，存在与越南病毒株间的多次传播[5]。通过对这五位外来婚嫁女的流行病调查，她们的来源也和分析相符。

Stoeckli认为，与env区8%～17%这样较高的个体间变异率相比[6]，gag基因变异率稍低，在个体间的变异率为2.7%～5.9%。本研究结果与上述报道也一致。

影响特殊亚型和流行重组病毒的流行和传播的因素仍然不清楚，新的亚型或重组病毒不断在形成，并有可能成为新的流行病毒株，但是病毒变异和重组的特性是推动艾滋病变异的主要动力[7]。通过对外来婚嫁女HIV亚型分析，对我市HIV的来源将有更充分的认识，这有利于艾滋病的预防和控制，对防止二代感染也有积极的意义。

[1] 唐力，刑辉，等. 武汉市HIV-1相关基因序列分析及亚型分布[J]. 中国人兽共患病学报，2007,23(11)：1071.

[2] Cohen CJ, Hunt S, Sension M, et al. A randomized trial assessing the impact of phenotypic resistance testing on antiretroviral therapy[J]. Aids,2002,579-588.

[3] 刘翌．艾滋病病毒分子亚型流行病学研究进展[J]．中国国境卫生检疫杂志，2006，( S1):146-150．

[4] Huang W,Eshliman SH,Toma J, er al.Coreceptor tiopism in human immunodeficiency virus type 1 subtype D ;high prevalence of CXCR4 tropism and heterogeeneous composition of viral population[J].J virol, 2007,81(15):7885-7893.

[5] Cheng CL,Fan Y,Wu SL, et al.Genetic characteristies of HIV-1CRF01-AE strains in four provinces, southern China[J].Zhonghua Liuxingbingxue Zazhi,2009,30(1):720-725.

[6] Stoeckli TC，MaWhinney S，Uy J，et al.Phenotypic and genotypic analysis of biologically cloned human immunodeficieney vuris type 1 isolates from Patients treated with zidovudine and lamivudine[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2002,46:4000-4003.

[7] 程华，钟平.艾滋病病毒亚型及其影响[J]. 中国病毒学杂志，2011,1(2)：147-153.