幽门螺杆菌唾液酸结合黏附素（SabA）的克隆表达＊

李冬宏，宫雅楠，肖 迪，周南进，谢 勇，张建中

幽门螺杆菌唾液酸结合黏附素（SabA）的克隆表达＊

李冬宏1，2，宫雅楠1，肖 迪1，周南进2，谢 勇3，张建中1

目的构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，简称H．pylori或Hp）唾液酸结合黏附素（sialic acid－binding adhesion，Sab A）的重组质粒，并在大肠杆菌BL21中表达，为探讨Sab A的功能及相关疫苗的发展提供帮助。方法以Hp 26695株基因组为模板，设计sabA基因特异性引物扩增目的基因，将PCR产物插入到pGEX－4T－1载体构建重组质粒，在大肠杆菌BL21中诱导表达。表达蛋白经飞行质谱鉴定，并用免疫印迹法评价其抗原性。结果经SDS－PAGE和飞行质谱鉴定，该表达蛋白为Hp外膜蛋白Sab A，经免疫印法迹检测具有良好的抗原性。结论成功克隆了Hp的Sab A，并能在大肠杆菌BL21中表达，该蛋白具有良好的抗原性。

幽门螺杆菌；唾液酸黏附素；基因克隆；表达

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H．pylori或Hp）感染与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃黏膜相关淋巴样组织（MALT）淋巴瘤的发病密切［1－3］。Hp的定植是致病的前提，而黏附素对其定植有着至关重要的作用。唾液酸结合黏附素（sialic acidbinding adhesion，Sab A）是新近发现的一种黏附素，它又称Hp外膜蛋白17（outer membrane protein，OMP17），在Hp致病中起着重要作用，它与胃黏膜萎缩、肠上皮化生和胃癌的发生密切相关［4］。本研究拟构建sab A重组质粒，并对表达的Sab A进行初步探讨，为后续致病机理研究和以其为靶点的Hp疫苗研究奠定基础。

1 材料和方法

1．1 材料 Hp 26695菌株及表达质粒p GEX－4T－1为中国疾病预防控制中心传染病所诊断室（传染病预防控制国家重点实验室）保存；大肠杆菌BL21、琼脂糖、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司；限制性内切酶Bam HⅠ、XhoⅠ、Ta KaRa LA Taq酶、1 kb DNA Ladder Marker、T4DNA连接酶均购自Ta KaRa公司；QIAamp DNA Mini Kit购自QIAGEN公司。1．2 方法

1．2．1 基因组和表达质粒的提取 按照QIAamp DNA Mini Kit和质粒小提试剂盒的操作方法，提取Hp 26695菌株的基因组和表达质粒p GEX－4T－1。

1．2．2 目的基因的扩增 根据 GenBank（ID：899697）中Hp 26695菌株omp17基因序列，利用Primer Premier 5软件设计特异性引物，并在5′端加入合适的内切酶位点，引物由上海生工生物有限公司合成。引物序列如下：

上游引物ATGGATCCAGCGCCGGCTATCAAATCG，

下游引物CGCTCGAGTCAGTAAGCGAACACATAATTGAGATA

上下游引物分别加入的酶切位点为Bam HⅠ、XhoⅠ。采用聚合酶链反应（PCR）以Hp 26695菌株基因组为模板扩增sabA基因片段，其反应条件为：预变性95℃10 min、变性95℃1 min、退火55℃1 min、延伸72℃2 min、终延伸72℃5 min，35个循环。所获PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，其方法按试剂盒操作。1．2．3 pGEX－4T－1／sab A重组质粒的构建 取回收后的PCR产物和提取的表达质粒进行Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切反应，琼脂糖凝胶鉴定后回收。后将回收产物进行连接反应，其中PCR产物与p GEX－4T－1比例为1∶3，金属浴16℃过夜连接，连接产物转化至E．coli BL21后，并涂布于含有氨苄青霉素（100μg／m L）的LB固体培养基上培养过夜，其详细方法参见《分子生物学实验指南》［5］。

1．2．4 重组质粒的鉴定 挑取单克隆菌落，提取质粒做质粒PCR，然后用限制性内切酶Bam HⅠ、XhoⅠ30℃酶切1 h后再37℃酶切3 h，鉴定重组质粒是否构建成功。

1．2．5 诱导表达及表达产物的SDS－PAGE经鉴定成功的阳性克隆株在LB液体培养基中37℃培养过夜，然后按照1∶100转接至含氨苄青霉素的LB培养基中，继续培养至OD600值为0．6～0．8时，加入终浓度为1．0 mmol／L的IPTG，诱导4 h。收集菌液，将菌液用PBS清洗，离心弃上清，再加入30 μLPBS和10μL蛋白上样缓冲液煮沸10 min后进行12%SDS－PAGE分析。

1．2．6 飞行质谱鉴定 诱导表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）后，在凝胶的相应位置切下表达蛋白条带，按照飞行质谱样制备操作流程制备质谱样，然后经过4700 MALDI－TOF－MS蛋白质组分析系统分析鉴定是否为Sab A。

1．2．7 免疫印迹 将诱导表达菌样品进行SDSPAGE，再转到0．45μm的PVDF膜上，用抗 Hp 26695全菌蛋白免疫兔血清（1∶100稀释，抗体由中国疾病预防控制中心传染病所诊断室制备）室温孵育3 h，再用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶10 000稀释）室温孵育2 h，用DAB显色。

2 结 果

2．1 sabA基因的扩增 以Hp 26695基因组DNA为模板进行目的基因扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到一条大小约1 890bp的片段，与目的基因的大小相符（图1）。

图1 PCR产物凝胶电泳分析1：1 kb DNA Ladder Marker；2：阴性对照；3：PCR 扩增sabA产物Fig．1 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR products 1：1 kb DNA Ladder Marker；2：negative control；3：sab A of PCR products

2．2 重组质粒的酶切鉴定 将重组质粒p GEX－4T－1－sab A经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后1%凝胶电泳鉴定，得到两条目的条带，大小分别约为4 969bp（p GEX－4T－1）和1 890bp（sabA），符合预期结果（图2），证明重组质粒构建成功。

2．3 诱导表达产物的SDS－PAGE和飞行质谱鉴定包含重组质粒p GEX－4T－1－sab A的菌株经诱导后进行12%SDS－PAGE，发现在90 k D附近出现大量表达蛋白条带，与预计大小95 k D（含GET标签蛋白26 k D）相比稍微偏小（图3），切下该处的蛋白条带按质谱样制作标准流程制备质谱样，经飞行质谱分析，为Hp外膜蛋白17（表1），表明该重组质粒在E．coli BL21中成功表达Sab A。

2．4 免疫印迹 将12%SDS－PAGE分离的蛋白样转移至PVDF膜上，Western blot结果显示在95k D附近出现了一条特异性条带，且条带位置与SDSPAGE图中目的条带位置一致，说明表达蛋白具有良好的抗原性（图4）。

图2 重组质粒pGEX－4T－1－sabA双酶切电泳图1：重组质粒pGEX－4T－1－sab A双酶切样品；2：重组质粒pGEX－4T－1－sab A样品；3：1 kb DNA Ladder MarkerFig．2 Identification of recombinant plasmid pGEX－4T－1／sabA by restricted endonuclease enzymes 1：Digested by Bam HⅠand XhoⅠ；2：Recombinant plasmid pGEX－4T－1／sab A；3：1 kb DNA Ladder Marker

图3 诱导表达产物SDS－PAGE图1：重组质粒pGEX－4T－1－sab A未诱导样品；2：重组质粒pGEX－4T－1－sab A诱导样品；3：空pGEX－4T－1诱导样品；4：E．coli BL21未诱导样品；5：E．coli BL21诱导样品；6：蛋白 MarkerFig．3 SDS－PAGE analysis of Sab A recombinant protein expressed in BL21 1：recombinant plasmid p GEX－4T－1／sab A before induction；2：recombinant plasmid p GEX－4T－1／sab A induction with IPTG；3：plasmid p GEX－4T－1 induction with IPTG；4：E．coli BL21 before induction；5：E．coli BL21 induction with IPTG；6：molecular mass marker

表1 诱导表达蛋白飞行质谱鉴定结果Tab．1 Identification of SabA recombinant protein by time－of－flight mass spectrometry

3 讨 论

Hp粘附于人胃黏膜必须有特异的黏附素和相应受体，Hp的黏附素目前已知有二十多种，但受体明确的不多［6］。2002年Jafar等［7］在研究 CCUG 17875突变株时，意外发现CCUG 17875 bab A2突变株能与感染Hp的胃炎病人的胃黏膜结合，从而发现了一种新的黏附素Sab A，它能够特异性地与胃黏膜上皮细胞表面的唾液酸化的路易斯（sialyl－Lewis X／A，s LeX／A）抗原结合，并对sab A 阳性菌株的定植起着重要作用［8］。在Hp感染初期，Bab A与Leb血型抗原结合有利于Hp在胃黏膜的定植，然而随着炎症的加剧，胃黏膜上皮s LeX／A表达增加，Hp就要通过Sab A在胃黏膜定植。SLeX／A是唾液酸糖复合物，它在正常胃黏膜中含量很少，但是随着Hp感染和其诱导的炎症持续存在，正常状态下胃黏膜的路易斯抗原被s LeX／A取代［9］。虽然目前国外学者对 Hp的Sab A进行了研究［10－14］，但至今人们对Sab A在Hp粘附过程中的作用及其功能尚不是十分清楚，其致病机理还有待进一步研究探讨。

图4 表达蛋白免疫印迹1：重组质粒p GEX－4T－1－sab A诱导样品；2：重组质粒pGEX－4T－1－sab A未诱导样品；3：空 pGEX－4T－1诱导样品；4：E．coli BL21诱导样品；5：Hp全菌蛋白；6：蛋白markerFig．4 Protein expression by immunoblot analysis 1：recombinant plasmid p GEX－4T－1／sab A induction with IPTG；2：recombinant plasmid pGEX－4T－1／sab A before induction；3： plasmid p GEX －4T－1induction with IPTG；4：E．coli BL21 induction with IPTG；5：Helicobacter pylori whole cell protein；6：molecular mass marker

随着生物技术的发展，蛋白质结晶逐渐应用于分子的生物学功能研究的这一领域，并有着重要的意义。本研究构建的重组质粒p GEX－4T－1－sab A表达蛋白中含有GST标签，便于该融合蛋白的纯化，为该蛋白质的结晶创造了有利的物质条件，并对分析该蛋白的三级结构及推测相关生物学功能奠定了基础，从而探索出研究该蛋白功能的新途径，这为深入研究Sab A的功能和致病机制奠定了基础。

基因工程疫苗是防治Hp感染的一种很有前途的手段，而Hp外膜蛋白大多数位于细菌表面，具有表面暴露的特性，能引起机体的免疫反应，因此许多Hp疫苗的研究均以其外膜蛋白疫苗为抗原［15－16］。粘附是Hp感染的先决条件，也是致病的关键，编码黏附素的sabA基因为Hp所特有，并在不同菌株相对保守，通过比对Hp 26695与Hp SJM180、B8、J99、P12、HPAG1、PeCan4、B38的sab A 基因的核苷酸序列和氨基酸序列，发现其核苷酸序列同源性都在87%～95%，氨基酸序列同源性在78%～94%，其中在Hp P12株变异程度最大，剔除Hp P12株信息后基因序列同源性都在91%以上，氨基酸序列同源性都在89%以上。这结果表明虽然sab A基因存在多态性，但相对于其他蛋白该外膜蛋白更保守。本研究通过Western blot进一步分析，发现该表达蛋白具有良好抗原性，提示Sab A有望成为Hp疫苗研究的候选抗原成分。

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Cloning and expressing of Helicobacter pylori sialic acid－binding adhesion（SabA）

LI Dong－hong1，2，GONG Ya－nan2，XIAO Di2，ZHOU Nan－jin1，XIE Yong3，ZHANG jian－zhong2
（1．The Medical Institute of Nanchang University，Nanchang 330006，China；2．Department of Diagnosis National Institute for Communicable Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China；3．Institute of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China）

The aim was to construct a recombinant plasmid that expresses the Helicobacter pylori（H．pylori）sialic acid－binding adhesion（Sab A）for the further study of vaccine and function of Sab A．The primers were designed according to the sequence of the H．pylori 26695 sab A gene．PCR products were inserted into expression vector pGEX－4T－1，and transformed into E．coli BL21 strain for the expression．The recombinant protein was identified by MALDI－TOF－MS and the antigenicity was tested by Western blot．Results indicated that the recombinant protein was identified as H．pylori outer membrane protein Sab A by SDS－PAGE and MALDI－TOF－MS，which showed good antigenicity in Western blot．It＇s concluded that the gene sab A of H．pylori 26695 was successfully cloned and expressed in E．coli BL21，and the protein expressed has good antigenicity．

Helicobacter pylori；Sab A；gene cloning；expression

R378．2

A

1002－2694（2012）03－0197－04

＊国家科技支撑计划（No．2007BAI04B02）资助

张建中，Email：zhangjianzhong＠icdc．cn

1．中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室，传染病预防控制国家重点实验室，北京 102206；2．南昌大学医学科学研究所，南昌 330006；3．南昌大学第一附属医院消化研究所，南昌 330006

2011－10－27；

2012－01－05