星点设计-效应面法优化美洲大蠊提取工艺

张臻，宋芹，傅超美*，高飞，徐晓秋，盛菲亚

(1.成都中医药大学药学院，西部中药材开发与利用教育部重点实验室，四川成都611137;2.成都大学生物产业学院，四川成都610106)

美洲大蠊Periplaneta americana(L.)为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，入药始载于《神农本草经》，谓“味咸，寒，治血瘀，症坚，寒热，破积聚，喉咽痹，内寒无子”［1］。《本草纲目》上记载其主治“瘀血，症坚，寒热，下气，利血脉”，常用来治疗小儿疳积、疔疮、喉蛾、无名肿毒、膨胀、梅毒以及毒蛇、蜈蚣咬伤等疾病［2］。现代研究表明美洲大蠊化学成分众多，主要分为两大类:向体外释放的具挥发性的信息素类成分，包括性信息素和聚集信息素;存在于机体内部的氨基酸和蛋白质类成分［3-5］。其中的氨基酸、蛋白质既是美洲大蠊中含有量较高的成分，亦是美洲大蠊药效学的物质基础［6］。因此，本实验以干膏收率、氨基酸提取量、蛋白质提取量为评价指标考察美洲大蠊的提取工艺。

1 实验材料

1.1 实验药材美洲大蠊药材由四川好医生药业集团西昌美洲大蠊养殖基地提供，为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫美洲大蠊Periplaneta americana(L.)干燥虫体。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器酶标仪(美国thermo公司);Mili-Q超纯水处理仪(美国密理博公司);UV1100紫外可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司);恒温干燥箱(上海森杏实验有限公司，DGG-9240);电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司，DZKW-4);电子天平;电磁炉;96孔酶标板(NUNC MaxiSorp);蒸发皿。

1.2.2 试剂谷氨酸对照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号:G-025-110305);茚三酮(天津市瑞金特化学品有限公司，批号:110518);100T/96样考马斯亮蓝试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号:20110719);磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化亚锡均为分析纯。

2 方法与结果分析

2.1 星点实验设计根据文献［7-9］和预试验结果可知，影响美洲大蠊提取效果的主要因素是溶媒含乙醇量、提取时间和溶媒用量，因此，本试验以干膏收率、氨基酸提取量、蛋白质提取量为指标设计水平范围，见表1。

表1 影响因素与水平

2.2 提取试验方法取美洲大蠊药材25 g，精密称定，按星点设计(表1)回流提取两次，合并滤液，定容至500 mL，即得提取液，测其干膏收率、氨基酸提取量、蛋白质提取量。

2.3 干膏的测定取250 mL提取液置于已干燥至恒定质量的蒸发皿中，水浴挥干，残渣于105℃烘箱干燥3 h，移至干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量。由残渣质量与相应药材质量计算干膏收率。

2.4 氨基酸的测定

2.4.1 对照品溶液的制备取谷氨酸对照品适量，精密称定，置于10mL量瓶中，加蒸馏水配制成1 mg/mL的对照品母液［10-11］。

2.4.2 供试品溶液的制备量取0.15 mL提取液置于25 mL量瓶中，依次加入pH8.0的磷酸盐缓冲溶液1.0 mL，2%的茚三酮溶液［10］1.0 mL，在沸水浴中加热15 min，冷却后加超纯水定容至25 mL，即得。

2.4.3 方法学考察

2.4.3.1 线性关系考察取谷氨酸对照品母液，稀释10倍作为工作溶液，再取工作溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于一组25 mL量瓶中，各加磷酸盐缓冲溶液1.0 mL，2%茚三酮溶液1.0 mL，在沸水浴中加热15 min，冷却后加超纯水定容至25 mL，放置10 min后，以吸光度对应质量浓度绘制标准曲线，得到一元线性方程:Y=35.15X－0.124 6，r2=0.999，在0.005～0.025 mg/mL范围内呈良好线性关系。

2.4.3.2 精密度试验精密量取谷氨酸对照品工作溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL各3份于一组25 mL量瓶中，按2.4.2项下方法处理工作溶液，测定吸光度，平行试验3份，RSD＜2%，表明仪器精密度良好。

2.4.3.3 稳定性试验［12］分别精密量取谷氨酸对照品工作溶液3.0 mL置于量瓶中，按2.4.2项下方法处理工作溶液，分别于0.5、1.0、1.5、2 h测定吸光度，RSD值为2%，表明该方法在2 h内稳定。

2.4.3.4 重复性试验平行制备6份样品溶液，按以下公式［7］测定样品总氨基酸质量分数:(W—氨基酸总量，%;C—根据标准曲线查得的谷氨酸量，mg;L1—测定用试样量，mL;L2—试液总量，mL;M—试样质量，g;m—试样干物率，%)。计算美洲大蠊总氨基酸质量分数为4.35 mg/g，RSD值为2.5%，表明该方法重复性良好。

2.4.3.5 加样回收率试验取已知量的美洲大蠊药材1 g，精密称定6份，分别精密加入对照品适量，按2.4.2项下方法制备，测定并计算其平均回收率为99.36%，RSD值为1.52%。

2.4.4 氨基酸的测定取对照品或供试品置于25 mL量瓶中，加入pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液1.0 mL，2%的茚三酮溶液1.0 mL，在沸水浴中加热15 min，冷却后加超纯水定容。以相应试剂为空白，参照紫外-可见分光光度法，在570 nm处测定吸光度。

2.5 蛋白质测定方法以2.2项下所得提取液为样品母液，按考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒说明书项下操作，分别配制空白液、蛋白标准液、样品测定液。精密吸取每类溶液3份于3个酶标板孔中，每孔200 μL，放入酶标仪中测定各孔吸光度，按以下公式计算蛋白质质量浓度。蛋白质质量浓度×标准管质量浓度(0.563 g/L)

2.6 结果与分析

2.6.1 结果将干膏收率、氨基酸质量分数和蛋白质质量浓度3个指标均标准化为0～1之间的归一值，各指标“归一值”求算几何平均值，得三者的总评“归一值”(od)作为试验结果，试验安排及总评“归一值”见表2。“归一值”公式采用Hasson法［13］:

表2 试验设计与结果

2.6.2 模型拟合采用Design-Expert7软件对试验数据进行分析，拟合回归方程。多元线性回归方程为:OD=0.48－0.19A－0.009 473B+0.1C(R=0.716 2，P=0.000 1)。二次多项式方程为:OD=0.55－0.19A－0.009 473B+0.1C－0.011AB－0.002 769AC－0.021BC－0.078A2－0.013B2－0.018C2(R=0.830 9，P=0.007 0)。由拟合结果中的置信度P值和相关系数R值而言，二次多项式模型相对于线性拟合有较大提高。

2.6.3 效应面法优化提取工艺参数根据上述二次多项式模型，分别绘制效应面和等高线，并优选3个因素的最佳取值范围。结果见图1～3。

图1 OD值与A、B因素的效应面图

图2 OD值与A、C因素的效应面图

图3 OD值与B、C因素的效应面图

根据效应面图和等高图，选取较佳工艺范围:溶媒含乙醇量14.79%～18.0%，提取时间70～80 min，溶媒用量10～12倍。结合溶液配制的实际操作和工业生产可行性等因素，确定提取工艺的优化条件为:加入11倍15%的乙醇，提取75 min。

2.7 验证试验按该优选工艺进行提取3次，并比较预测值与真实值，结果见表3。

表3 最佳提取值范围

3 结论

美洲大蠊优化提取条件为:取美洲大蠊药材，加11倍量的15%乙醇提取两次，每次75 min，星点设计-效应面法筛选美洲大蠊最佳提取条件方法可行，建立的数学模型预测值良好。

4 讨论

4.1 氨基酸测定方法的确定经现代研究表明，美洲大蠊含有大量蛋白质、氨基酸、矿物质和微量元素等化学成分［14］，药理功效众多，如能抗肿瘤［15］、抗菌抗毒素、抗炎镇痛。虽然其食用和药用价值逐渐引起人们的重视，但对该药的药用价值评价指标的研究较少、稳定的评价方法也鲜见。根据对美洲大蠊的研究报道［16-17］，本试验确定以氨基酸含有量作为评价指标之一来评价提取工艺优劣。但实验中发现目前测定氨基酸的方法适用性差且重现性不好，不适用于测定美洲大蠊中的氨基酸，因此，在星点设计试验前，通过预实验对现有测定氨基酸的方法进行了改进，确定了制备供试品溶液时量取0.15 mL滤液来测定吸光度，所得的吸光度值在线性范围内。最终建立的美洲大蠊中氨基酸定量测定的方法具稳定可行、重复性好、灵敏度高。

4.2 提取溶媒范围的确定目前关于美洲大蠊有效成分的提取方法报道中主要溶媒有95%乙醇、90%乙醇、70%和水，因此本试验以文献报道中的溶媒进行了预实验，结果表明使用较高含醇量的乙醇为溶媒时不利于干膏的提取和氨基酸、蛋白质的溶出，因此本试验最终选取的溶媒范围极限值为水和70%乙醇，旨在保证较高的指标成分提取率和较优的筛选范围基础上，通过星点设计-效应面法优化筛选出以干膏收率、氨基酸提取量和蛋白质提取量为评价指标时的最优溶媒提取含乙醇量。

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