α-synuclein致病机制和转基因帕金森疾病模型研究进展

张 丽，张连峰

（中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021）

帕金森病（Parkinson＇s disease，PD）是最常见的慢性神经系统退行性病变之一，其主要症状是运动功能的改变，如运动过缓、静止震颤、步态畸形和姿势不稳等病变，最后导致运动能力丧失。流行病学调查显示，随着年龄增长PD患病率逐渐增高，55岁以上的人群中，帕金森病的患病率超过1％，65岁以上约为2％［1］。

PD按遗传发病形成可分为家族性与散发性两种，家族性PD约占PD总数的10％～15％左右，具有明显家族遗传倾向（显性或隐性），而散发性PD则占PD的绝大多数，无明显遗传倾向，但表现为某种遗传易感性。α-synuclein是一种位于突触前末梢的蛋白，该基因的两种错义突变与家族性帕金森病密切相关。大量研究发现α-synuclein存在于许多神经系统变性疾病的突触末梢或细胞浆包涵体中，揭示该基因参与了神经元的变性过程。

1 α-synuclein的表达与帕金森病

α-synuclein是一种分子量为14×103的小分子酸性可溶性蛋白。α-synuclein主要分布于神经元突触前末梢，尤其在脑内新皮层、海马、嗅球、纹状体、背侧丘脑、下丘脑、黑质及小脑等部位的神经元胞液中含量更加丰富［2］。PD病理特征是黑质纹状体多巴胺（dopamine，DA）神经元死亡，细胞质内类蛋白质物质减少以及特征性Lewy小体（lewy body，LB）。LB内多种蛋白质富集，包括α-synuclein、parkin、泛素等，其中，α-synuclein蛋白是其主要成分。作为LB的重要组成部分，α-synuclein既见于散发的帕金森病患者，又见于有α-synuclein基因突变的帕金森病患者［3］。在大小鼠中，过度表达的野生型或突变型α-synuclein均能引起人类帕金森病的部分关键表型和病理特征［4］。

2 α-synuclein神经元毒性机制

PD主要源于中脑黑质致密部多巴胺神经元退行性变导致的细胞死亡。α-synuclein的异常表达、聚集与神经元变性密切相关。根据目前的研究进展，可以将α-synuclein的神经元毒性机制概括为如下4个方面。

（1）α-synuclein寡聚体和路易小体

在α-synuclein蛋白纤维化的过程中，存在αsynuclein寡聚体、寡聚体中间构象——初原纤维（protofibrils）和最终的淀粉样纤维包涵体（fibrillar inclusions）等不同聚集状态［5-6］。首先，自然状态下，α-synuclein呈无序的未折叠结构的单体，但在高浓度时，它可转变成α-synuclein寡聚体的中间构象——初原纤维（protofibrils），与单体不同，这类寡聚体富含B片层结构，在原子力显微镜及电镜下，可以观察到这类寡聚体的形成过程中，这类寡聚体先呈包含20～30个α-synuclein分子的圆柱状结构，随后彼此聚合形成链条状，最终转化可溶性纤维多聚体。最后，借助于微管转运，细胞有时能将这些小球状的聚集物形成更大的包涵体，其中包含了纤维状的a-synuclein及其他几种蛋白质。其中寡聚体毒性机制可能是通过整合于细胞膜引起胞膜的瞬时通透性增加及膜内包含物的外渗［7-8］，初原纤维多聚体的出现则与破碎的高尔基器相关，是细胞变性的早期特征［9-10］，而包涵体（如路易小体）的形成可能是细胞自我保护的一种方式。

（2）线粒体功能障碍

线粒体功能障碍（主要是呼吸链功能异常）导致ATP合成衰竭也可出现帕金森病的临床表现，使用相应的药物可使早期帕金森病患者的症状缓解。因此，线粒体功能障碍是PD研究中解释神经元损伤一个重要机制。研究发现，α-synuclein基因过度高表达促进GT1-7细胞内线粒体形态改变，如线粒体肿胀、嵴空泡化［11］，在PC12细胞中引起线粒体去极化和诱发线粒体依赖的细胞死亡［12］，而且，表达α-synuclein的细胞对于蛋白复合体I抑制剂鱼藤酮更加敏感［13］。现已证实，α-synuclein可与线粒体呼吸系统的关键酶细胞色素C氧化酶（COX）特异结合［14］。但是胞浆里的α-synuclein如何接触、作用于线粒体内膜的机制尚有待阐明。

（3）内质网、高尔基体应激

α-synuclein过表达引起内质网应激、内质网-高尔基体囊泡运输障碍，进而干扰细胞或者神经元的正常功能［15］。在瞬时高表达α-synuclein的COS7细胞中观察到高尔基体碎片［9］，这可能是αsynuclein异常积聚导致的结果。PC12细胞中过表达α-synuclein，导致GRP 78和磷酸化的起始因子2α（eIF-2α）等两种内质网应激标记物表达上调，而内质网应激抑制剂salubrinal能够一定程度上防止细胞死亡［16］。内质网应激发生在α-synuclein诱导表达后的4～8 h之后和细胞死亡之前。在α-synuclein过表达果蝇模型上，通过增加囊泡运输调节蛋白Rab1的表达水平，能够一定程度上减少α-synuclein诱导的多巴胺神经元丢失［15］。值得警惕的是，降低内质网、高尔基体应激并不能完全逆转多巴胺神经元丢失，这表明在更复杂的系统中可能存在多种机制。然而，这些因素都还不能精确的解释α-synuclein如何影响内质网的，也不能真正解释DA神经元群在PD中的选择性损伤。

（4）氧化应激

多巴胺能神经元损伤是PD的主要病理特征，异常的a-synuclein聚集会破坏多巴胺的自身平衡，并增加黑质神经元的氧化应激。多巴胺在多巴胺能神经元胞质内合成后立即被转运到单胺能囊泡中储存，如果未被储存，多巴胺能够自氧化生成有毒性的多巴胺醌类物质，伴随超氧化基和过氧化氢产生［17-18］。在多巴胺能神经元中，变异a-synuclein导致囊泡数量减少，胞质内多巴胺浓度升高，使多巴胺依赖的氧化应激增强。在SH-SY5Y细胞内过度表达野生型和突变型的a-synuclein都会导致细胞内ROS水平升高，在多巴胺存在下，细胞存活数量大大减少，尤其是表达突变型的细胞［19］。因此，asynuclein聚集和多巴胺引起的氧化应激可能是PD发病机制的重要环节。

4 α-synuclein帕金森动物模型

为了阐明α-synuclein在PD中的可能作用机制，人们开始尝试建立各种动物模型包括转基因模型和病毒载体注射等其它模型。这些转基因模型不同程度模拟了PD患者的病理表型，如αsynuclein蛋白的聚集和病理性沉积，转基因动物表现出运动协调能力丧失等，表一对不同启动子调控表达的α-synuclein转基因动物模型的表型进行了比较。

表1 α-synuclein转基因大鼠、小鼠模型的关键表型比较Tab.1 Comparison of key phenotypes ofα-synuclein transgenic mice and ratmodels

（1）PDGF-βαSNCAWT转基因小鼠模型

Masliah等［4］制作和分析了人类野生型αsynuclein转基因小鼠。转基因小鼠可检测到胞浆及核内的有电子致密包涵体，DA能神经元减少、纹状体内酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）活性减低及运动行为障碍等。与人类PD不同的是，黑质内DA能神经元无变性缺失。

（2）PDGF-αSNCAA53T转基因小鼠模型

高宁等［20］建立了A53T突变型α-synuclein转基因小鼠，免疫组化显示，转基因小鼠大脑海马、新皮层、纹状体区出现人α-synuclein阳性标记的细胞。转棒实验结果显示，转基因小鼠存在明显的进行性运动能力障碍。

（3）PrP-αSNCAA30P转基因小鼠模型

αSNCAA30P转基因小鼠表现出进行性运动能力障碍，如僵直、步态畸形和静止震颤等。病理学结果发现，转基因小鼠中枢神经系统进行性神经胶质增生，未发现LB样α-synuclein包涵体，黑质多巴胺神经元系统无退行变性［21］。

（3）Thy1-αSNCAA53T和Thy1-αSNCAWT转基因小鼠模型

Putten等［22］制作了α-synuclein野生型和A53T突变型小鼠，结果发现两种转基因鼠的神经系统均出现了与PD病人相似的α-synuclein病理学改变。

（4）Thy1-αSNCAA30P和Thy1-αSNCAWT转基因小鼠模型

Kahle等［23］也通过建立转基因鼠研究野生型和A30P突变型α-synuclein的亚细胞定位，发现两种类型的α-synuclein在两种转基因鼠的神经元和轴突中都有异常聚集。

（5）α-Synuclein细菌人工染色体转基因小鼠（α-synuclein BAC）

Yamakado H等［24］建立人α-synuclein BAC转基因小鼠，该转基因小鼠表现出焦虑样行为（可能反映PD早期的非运动症状）减少，下降的SERT表达水平可能提示其内在分子机制。因此，α-synuclein BAC转基因小鼠可以作为评价α-synuclein剂量效应的工具，具有重要研究价值。

（6）四环素诱导型SNCAA53T转基因小鼠（tetOSNCAA53T）

Lin X等［25］成功建立了tetO-SNCAA53T转基因小鼠。与野生型小鼠相比，转基因小鼠呈现严重的运动障碍和中脑多巴胺能（mDA）神经元变性，模拟了PD关键的运动表型和病理表型。而且，mDA神经元也有明显的亚细胞改变，如多巴胺释放减少，高尔基体碎片，自噬体溶酶体系统损伤。此模型适用于PD的发病机制研究和α-synuclein蛋白积聚引发的神经损伤。

（7）α-synuclein转基因大鼠帕金森模型（Thy-A30P-A53T）

F.Lelan等［26］建立了Thy-A30P-A53T转基因SD大鼠，转基因大鼠虽然不存在运动障碍，但呈现出嗅觉障碍的PD早期非运动表型。人α-synuclein蛋白共定位于TH阳性的嗅球（OB）神经元上，而前脑脑室下区SVZ区则不表达。Thy-A30P-A53T转基因大鼠可以作为研究人突变的α-synuclein对于嗅觉障碍的发展机制的有用工具。

（8）重组腺伴随病毒介导α-synuclein过表达大鼠帕金森模型（rAAV-CBA-α-synuclein）

大鼠黒质纹状体注射rAAV-CBA-α-synuclein载体，α-synuclein野生型和突变型手术大鼠均表现出30～80％黒质多巴胺神经元丢失，纹状体内多巴胺水平下降40～50％。多巴胺神经元丢失50～60％以上的大鼠还表现出严重的运动功能障碍［27］。因此，rAAV-CBA-α-synuclein大鼠可以作为一种PD模型，它成功复制了人PD的主要病理特征、神经生化特征和行为学特征。

综上所述，大量研究工作揭示α-synuclein与神经元变性相关。首先，α-synuclein蛋白聚集，形成具有疏水性的寡聚体，表现出较强的细胞毒性。其次事件还包括ER内质网应激、线粒体功能障碍和氧化应激等。最后，以上事件激发的细胞死亡。这些结论都依赖于α-synuclein相关动物模型的发展［28-29］。这些动物模型惊人地重现了PD疾病的早期特征。因此，应合理地将其应用到PD发病机制研究及其药物治疗研究等领域，为PD的研究提供重要手段。

［1］Zhang ZX，Roman GC，Hong Z，et al.Parkinson’s disease in China：prevalence in Beijing，Xian，and Shanghai［J］.The Lancet，2005，365（9459）：595-597.

［2］Recchia A，Debtto P，Negro A，et al.Alpha-synuclein and Parkinson’s disease［J］.The FASEB Journal，2004；18（6）：617-626.

［3］Spillantini MG，SchmidtML，Lee VM，et al.alpha-synuclein in Lewy bodies［J］.Nature，1997，388（6645）：839-840.

［4］Masliah E，Rockenstein E，Veinbergs I，et al.Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice：implications for neurodegenerative disorders［J］.Science，2000，287（5456）：1265-1289.

［5］Caughey，B.，Lansbury，P.T.Protofibrils，pores，fibrils，and neurodegeneration：separating the responsible protein aggregates from the innocent bystanders［J］.Annu.Rev.Neurosci，2003，26：267-298.

［6］W right，J.A.，Wang，X.，Brown，D.R.Unique copperinduced oligomers mediate alpha-synuclein toxicity［J］.FASEB J.，2009，23（8）：2384-2393.

［7］Zakharov SD，Hulleman JD，Dutseva EA，et al.Helical alpha synuclein forms highly conductive ion channels［J］.Biochem istry，2007，46：14369-14379.

［8］Waxman EA，Giasson BI.Molecular Mechanisms ofα-Synuclein Neurodegeneration［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1792（7）：616-624.

［9］Gosavi N，Lee HJ，Lee JS，et al.Golgi fragmentation occurs in the cells with prefibrillar alphasynuclein aggregates and precedes the formation of fibrillar inclusion［J］.J Biol Chem，2002，277：48984-48992.

［10］Fan J，Hu Z，Zeng L，et al.Golgi apparatus and neurodegenerative diseases［J］.Int J Dev Neurosci，2008，26 （6）：523-34.

［11］Hsu LJ，Sagara Y，Arroyo A，et al.alpha-synuclein promotes mitochondrial deficit and oxidative stress［J］.Am J Pathol，2000，157：401-410.

［12］Tanaka Y，Engelender S，Igarashi S，et al.Inducible expression of mutant alpha-synuclein decreases proteasome activity and increases sensitivity to mitochondria-dependent apoptosis［J］.Hum Mol Genet，2001，10：919-926.

［13］Orth M，Tabrizi SJ，Schapira AH，et al.Alpha-synuclein expression in HEK293 cells enhances the mitochondrial sensitivity to rotenone［J］.Neurosci Lett，2003，351：29-32.

［14］Elkon H，Don J，Melamed E，et al.Mutantand wild-type alphasynuclein interactwith mitochondrial cytochrome C oxidase［J］.J Mol Neurosci，2002，18：229-238.

［15］Cooper AA，Gitler AD，Cashikar A，et al.Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’smodels［J］.Science，2006，313：324-328.

［16］Smith WW，Jiang H，Pei Z，et al.Endoplasmic reticulum stress and mitochondrial cell death pathways mediate A53T mutant alpha synuclein-induced toxicity［J］.Hum Mol Genet，2005，14：3801-3811.

［17］Stokes AH，Hastings TG，Vrana KE.Cytotoxic and genotoxic potential of dopamine［J］.J Neurosci Res，1999，55：659 -665.

［18］Maguire-Zeiss KA，Short DW，Federoff HJ.Synuclein，dopamine and oxidative stress：co-conspirators in Parkinson’s disease［J］?Brain Res Mol Brain Res，2005，134：18-23

［19］Junn E，Mouradian MM.Human alpha-synuclein over-expression increases intracellular reractive oxygenspecies levels and susceptibility to dopamine［J］.Neuorsci Lett，2002，320（3）：146-150.

［20］高宁，全熊志，陈炜，等.帕金森病a-Synuclein转基因小鼠模型的建立［J］.中国比较医学杂志，2008，18（5）：28-31.

［21］Gomez-Isla T，Irizarry MC，Mariash A，et al.Motor dysfunction and gliosis with preserved dopaminergic markers in humanα-synuclein A30P transgenic mice［J］.Neurobiology of Aging，2003，24（2）：245-258.

［22］Putten H，W iederhold KH，Probst A，et al.Neuropathology in mice expressing human alpha-synuclein［J］.JNeurosci，2000，20（16）：6021-6029

［23］Kahle PJ，Neumann M，Ozmen L，et al.Subcellular localization of wild-type and Parkinsons disease-associated mutantα -synuclein in human and transgenic mouse brain［J］.JNeurosci，2000，20：6365-6373

［24］Yamakado H，Moriwaki Y，Yamasaki N，et al.α-Synuclein BAC transgenic mice as a model for Parkinson＇s disease manifested decreased anxiety-like behavior and hyperlocomotion［J］.Neurosci Res，2012，73（2）：173-177.

［25］Lin X，Parisiadou L，Sgobio C，et al.Conditional Expression of Parkinson＇s Disease-Related Mutant alpha-Synuclein in the Midbrain Dopaminergic Neurons Causes Progressive Neurodegeneration and Degradation of Transcription Factor Nuclear Receptor Related 1［J］.J Neurosci，2012，32（27）：9248-9264.

［26］F.Lelan，L.Lescaudron，C.Boyer，et al.Effects of human alpha-synuclein A53T-A30Pmutations on SVZ and local olfactory bulb cell proliferation in a transgenic rat model of Parkinson disease［J］.Parkinson’s Disease，vol.2011，Article ID 987084，11 pages，2011.

［27］Kirik D，Rosenblad C，Burger C，et al.Parkinson-Like neurodegeneration induced by targeted overexpression ofαsynuclein in the nigrostriatal system［J］.The Journal of Neuroscience，2002，22（7）：2780-2791.

［28］Blesa J，Phani S，Jackson-Lewis V，et al.Classic and New Animal Models of Parkinson＇s Disease［J］.JBiomed Biotechnol，2012；2012：845618.

［29］Jackson-Lewis V，Blesa J，Przedborski S.Animal models of Parkinson＇s disease［J］.Parkinsonism Relat Disord，2012，18 （Suppl 1）：S183-5.