甜菜夜蛾核多角体病毒可湿性粉剂生产技术的研究

徐树兰，陈其津

（1.中山大学生命科学学院，广州，510275；2.广州市生物防治站）

甜菜夜蛾核多角体病毒可湿性粉剂生产技术的研究

徐树兰2，陈其津1

（1.中山大学生命科学学院，广州，510275；2.广州市生物防治站）

报道了甜菜夜蛾核多角体病毒可湿性粉剂的生产关键技术，包括甜菜夜蛾的饲养，多角体病毒的增殖，可湿性粉剂的生产，产品质量检测等。

甜菜夜蛾核多角体病毒；可湿性粉剂；生产工艺流程；关键技术

甜菜夜蛾核多角体病毒 （Spodoptera exigua Nucleopolyhedrovirus，SeNPV）是一种能有效防治甜菜夜蛾（Spodoptera exiguaHübner）的昆虫病原微生物。20世纪60-70年代以来，国内外学者在病毒的分离鉴定、毒力测定、致病机理、分子生物学、病毒制剂的研究以及田间应用等方面做了许多工作[1～4]，但是有关SeNPV杀虫剂的产业化生产的研究报道较少。1998年以来，本课题组在SeNPV杀虫剂研制和生产方面做了大量的工作[5]，建立了一套完整的利用人工半合成饲料规模化饲养甜菜夜蛾，增殖SeNPV，并加工成SeNPV可湿性粉剂的生产工艺流程。现介绍如下，以便为工厂化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甜菜夜蛾由广州市中达生物工程有限公司养虫车间提供。人工半合成饲料原料为黄豆粉和麦麸，由市场购得；酵母粉，安琪酵母股份有限公司生产；L-抗坏血酸，郑州锦德化工有限公司生产；尼泊金，广州市升月化工有限公司生产；山梨酸，泰州市明光食品添加剂有限公司生产；琼脂，广州海洋生物有限公司生产。

表1 人工半合成饲料配方

1.2 试验方法

①甜菜夜蛾人工饲养 a.人工半合成饲料配制。人工半合成饲料按照表1的配方进行配制。先用500 mL水调匀黄豆粉、酵母粉和麦麸，另500 mL水用于煮融琼脂，两者混匀后经121℃蒸气灭菌30 min。待压力表降至零时，取出饲料，加入山梨酸和泥泊金，边加边搅拌均匀。当饲料温度降至50℃左右，再加入其余成分。充分搅拌均匀，冷却后置于4℃冰箱备用。如要做平面饲料，则趁热倒入直径13 cm，高3.5 cm的圆形塑料盒中，厚度3～4 mm。

b.甜菜夜蛾人工饲养技术。卵消毒及孵化：在卵孵化前1 d，放入5%（v/v）甲醛溶液中消毒15 min，用无菌水漂洗干净，晾干，然后放在圆形塑料盒（13 cm×14 cm）中孵化，记录孵化率。培养温度为25℃，相对湿度（75±5）%，L∶D=12∶12。

幼虫饲养：卵孵化完毕后，将产卵的纸移走，并根据虫口密度适当添加饲料。当幼虫饲养至四龄时，将幼虫转移至方形塑料盒（35 cm×25 cm×10 cm）中，使每盒幼虫量为300头左右。饲养温度为25℃，相对湿度（75±5）%，L∶D=12∶12。

蛹的管理：在方形塑料盒（35 cm×25 cm× 10 cm）中，放入5 cm厚的已经高温消毒的沙子。沙上放一块铁丝网，并投放人工饲料，当老熟幼虫全部入沙营造蛹室时，取走铁丝网，盖纸避光。每盒可供300～350头幼虫化蛹，待蛹变棕黑色后，挑选个体大，有光泽，有活力的蛹，放入交配产卵箱羽化。饲养温度为25℃，相对湿度（75±5）%，L∶D=12∶12。

成虫管理：在蛹羽化前1 d将50对蛹放入笼中。待蛹羽化后，在笼底放入折叠的小纸条，小纸条要覆盖过笼子底板，笼顶贴一块纱布。放入10%蜂蜜水5～6 mL。每日收取所产卵，直至全部成虫产卵完毕。饲养温度（27±1）℃，相对湿度75%±5%，L∶D= 14∶10。

②多角体病毒的增殖 采用群养的方法[5]，对5个批次的五龄初甜菜夜蛾幼虫进行涂毒感染，感染温度为（27±1）℃，感染浓度为1×108PIB/mL，饲养密度为30头/dm2的，然后统计5个批次的单头幼虫的病毒产量和病毒总产量，考察是否能达到产业化生产的要求。

③可湿性粉剂的生产 SeNPV干燥：将病虫尸体与自来水按1∶10比例混合后，倒进电动匀浆过滤机研磨过滤，经显微计数确定含量后，加入少许填充料搅拌均匀，放置在热泵干燥机内干燥，干燥后的病毒中间体要求水分含量不能超过8%。

SeNPV粉碎：将干燥后的病毒中间体放进流化床气流粉碎机内进行粉碎，粉碎后的病毒粉体细度要达到300目筛以上，含量约为500亿PIB/g。

SeNPV WP包装：将粉碎后每1 g含量为500亿PIB的病毒粉体与填充料、助剂按配方比例配成含量为50亿PIB/g的SeNPV WP。经搅拌机充分搅拌均匀后，经DXDS180型水平式全自动包装机包装，每袋净质量为20 g，每1 h产量可达2 500袋。

④可湿性粉剂的质量检测 按照农药可湿性粉剂产品标准[6]编写规范中的有关方法进行检测。多角体病毒含量的测定采用血球计数板法；病毒杀虫活性的测定采用致死中浓度测定法；悬浮率的测定按照GB/T 14825中农药悬浮率测定方法中的方法1进行；润湿时间的测定按GB/T 5451的方法进行；细度的测定按GB/T 16150中湿筛法进行；pH值的测定按GB/T 1601中pH计法进行；水分的测定按GB/T 1600中共沸蒸馏法进行。

表2 人工半合成饲料饲养的5个批次甜菜夜蛾生长发育情况

表3 5个批次甜菜夜蛾幼虫病毒增殖的结果

表4 5个批次产品质量控制指标的实测值

2 结果与分析

2.1 健康幼虫的饲养

大规模饲养甜菜夜蛾生产SeNPV杀虫剂时，幼虫存活率、幼虫历期、老龄幼虫体重及世代历期是影响产品产量和成本的最重要的指标。采用本课题组研究出的人工半合成饲料配方和上述饲养条件对5个批次的甜菜夜蛾进行大规模饲养，得到的甜菜夜蛾生长发育的各项指标，见表2。

从该研究结果可以看出，甜菜夜蛾幼虫的平均存活率为91.54%，显著高于徐金汉等[7]报道的人工半合成饲料的饲养效果，与赵国营等[8]报道人工半合成饲料的效果相当，而平均幼虫历期和平均世代历期则略高于赵国营等的报道。但该饲料配方组分较徐金汉和赵国营的简单，成本低廉。因此，利用该饲料大规模饲养甜菜夜蛾增殖SeNPV，可达到产业化生产SeNPV可湿性粉剂的要求。

2.2 SeNPV的增殖

从表3可以看出，5个批次甜菜夜蛾幼虫病毒增殖的结果差异不显著。平均幼虫死亡率可达83.7%，平均单头幼虫病毒产量为15.79×108PIB，平均病毒总产量达3 963.29×108PIB，与本课题组之前的报道相符[5]，从死亡率和病毒总产量来看，较适宜工厂化生产SeNPV杀虫剂的需求。

2.3 可湿性粉剂的生产

将感染了SeNPV死亡的虫尸通过机械匀浆过滤、热泵干燥机干燥、气流粉碎机粉碎、全自动包装机包装后即可获得含量为50亿PIB/g的SeNPV可湿性粉剂。具体指标检测结果见表4，生产工艺流程见图1。

图1 SeNPV可湿性粉剂生产工艺流程

2.4 产品质量检测

随机抽取5个批次的样品，进行各项质量控制指标的检测，均符合产品企业标准的要求，结果见表4。

3 小结与讨论

SeNPV可湿性粉剂产业化生产中遇到的主要技术难题有两个，一为甜菜夜蛾的人工饲养；二为SeNPV的增殖。要实现甜菜夜蛾的人工饲养，首先要解决甜菜夜蛾的人工饲料。有关甜菜夜蛾人工饲料的研究，前人有很多的报道[7～9]，但这些饲料配方多存在含有“叶因子”或配方组分复杂的缺陷，难以适应工厂化饲养甜菜夜蛾的需要。本研究采用的人工半合成饲料不含“叶因子”、原料来源广、成本低，且饲养效果好，非常适合工厂化甜菜夜蛾的饲养。而适宜的甜菜夜蛾人工饲养技术是实现其大规模饲养的另一重要内容。

目前，甜菜夜蛾在实验室小规模饲养的基本程序是将初孵幼虫单头放入小塑料杯，或在小容器内低密度饲养，幼虫成熟后转至铺有沙子的容器内化蛹，然后将蛹自沙内取出，如此饲养，不仅成本高，而且相当费时，难以进行规模化饲养[10，11]。而试验采用甜菜夜蛾群养的饲养方法，操作简便，减少了工作量，较好地解决了该问题。昆虫病毒的增殖方法主要有两种，组织培养法和活体增殖法[2]，由于组织培养法成本高、操作繁琐，不适合大规模、廉价生产感染力强的病毒。因此，活体增殖法是实现SeNPV大规模繁殖的主要方法。昆虫病毒在宿主细胞内进行增殖时，其增殖速度和数量受多种因素的影响，包括营养、接毒量、环境因子、虫龄等[12]。在前期的研究中，我们已经发现不同的接种龄期和接种浓度是影响SeNPV产量的主要因素[5]。本研究结果也进一步说明，当进行大规模SeNPV增殖时，选择接种浓度为1×108PIB/mL，接种龄期为五龄初甜菜夜蛾幼虫时，获得的病毒产量最高，产品生产成本最低。

本试验通过解决以上2个技术难题，开发出了SeNPV可湿性粉剂的生产工艺流程，不仅为其大规模工厂化生产提供了可靠的的依据，还填补了国内外在此方面的空白。

[1]陈其津，李广宏，庞义，等.甜菜夜蛾核多角体病毒杀虫剂研究进展[J].中国病毒学，2000，15（杀虫微生物专刊）：234-235.

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[3]王敏杰，顿美阁，郑志国.甜菜夜蛾发生与综合防治技术[J].河南农业，2009（9）：19.

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[5]徐树兰，李辉，陈其津.甜菜夜蛾核型多角体病毒的致病力测定与群养对病毒产量的影响[J].长江蔬菜，2010（18）：10-12.

[6]中华人民共和国国家发展和改革委员会.中华人民共和国行业标准：农药可湿性粉剂产品标准编写规范[S].化学工业出版社，2004.

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[8]赵国营，谷希树，刘强.甜菜夜蛾人工饲料配方的改进研究[J].山东农业科学，2009（5）：74-76.

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Production Technology ofSpodoptera exiguaHübner Nucleopolyhedrovirus Wettable Powder

XU Shulan2,CHEN Qijin1
(1.College of Life Sciences,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275;2.Biology Control Station of Guangzhou)

The article reported the key production technology ofSpodoptera exiguanucleopolyhedrovirus wettable powder (WP),including the rearing ofS.exigua,the proliferation ofS.exiguanucleopolyhedrovirus,the production ofS.exigua nucleopolyhedrovirus WP and quality testing of products.

Spodoptera exiguanucleopolyhedrovirus;Wettable powder;Production process;Key technology

=85,ebook=90

10.3865/j.issn.1001-3547.2012.14.032

公益性行业（农业）科研专项项目（200803007），广东省农业领域专项基金项目（2009A020101003），广州市科技计划项目（2010Z1-E281）

徐树兰（1981-），女，硕士，主要从事微生物杀虫剂的研究，E-mail：xushujuan_21@163.com

陈其津，通信作者，电话：13610044229，E-mail：lsscqj@mail.sysu.edu.cn

2012-03-26