猫棒束孢真菌液体发酵工艺研究

杨喜花，张生万 *，任连生

（1.山西大学生命科学学院，山西 太原 030006；2.山西大学化学化工学院，山西 太原 030006；3.山西省肿瘤研究所比较医学部，山西 太原 030013）

猫棒束孢（Isaria felina）是从天然冬虫夏草子实体中经菌种分离后培养得到的一株真菌，经中国科学院微生物研究所郭英兰教授鉴定为Isaria felina（DC.：Fr.）Fr.，在分类上属于半知菌纲、丛梗孢目、棒束孢属。该菌种已被中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（保藏号：CGMCCNO.0706），是一种新的冬虫夏草菌种。国内外目前关于猫棒束孢的研究报道较少。郭永霞从猫棒束孢菌丝体中分离纯化得到具有抗真菌作用的环缩肽isarfelin，并对isarfelin进行了理化性质的分析、结构鉴定，并发现isarfelin具有抑制细菌、抵抗真菌的活性[1]。BAUTER、Deffieux G等从猫棒束孢中提取分离得到环羧酚酸肽结构的具有杀虫作用的成分Isariins B，C和D，并对Isariins B，C和D的结构进行了鉴定[2-3]。IKUMOTOT等研究发现Isaria felina的浸出液对离体心房有负收缩效应，同时对电刺激回肠的收缩反应及人血小板的凝结有抑制作用[4]。天然冬虫夏草是我国传统的名贵中草药，具有保肺益肾等补益功能[5-6]，对肾脏组织有一定的保护和修复作用，临床上多用于慢性肾病的治疗[7]，由于天然冬虫夏草价格昂贵，现一般多用从天然冬虫夏草中分离得到的菌种经人工培养获得的菌丝体代替，如百令胶囊、金水宝胶囊等[8]。而我们前期研究结果表明，猫棒束孢对腺嘌呤诱导的慢性肾衰及甘油诱导的急性肾衰均有很好的治疗作用，因此猫棒束孢具有远大的开发应用前景，有希望开发为肾病治疗药物。本文就猫棒束孢的液体发酵工艺进行优化实验研究，从而可以增加猫棒束孢的产量，为工业化生产猫棒束孢提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

猫棒束孢菌种，于山西省肿瘤研究所比较医学部保藏。

1.2 试剂

蛋白胨，酵母膏，酵母粉，蔗糖，硫酸镁，磷酸二氢钾，碳酸氢钠。

1.3 主要仪器

HZ-9310K型全温振荡器：太仓市科技器材厂；光学显微镜：日本Olympus CX21FS1；笔式pH计：上海虹益器材仪表有限公司；生物安全柜：青岛海尔医用低温科技有限公司；低速冷冻离心机：科大创新股份有限公司KDC-2044；876-1型真空干燥箱：上海新诺仪器厂。

1.4 实验方法

将一定体积的培养基装于3000mL三角瓶中，牛皮纸封口，125℃高压灭菌40min，冷却至室温，接入菌种，置于180r/min摇床上，于一定温度条件下旋转发酵培养，收集发酵液，将发酵液于2000r/min离心5min，得菌丝体及上清液，分别于80℃烘24h，测干重。

2 结果

2.1 培养基的选择

将猫棒束孢菌种分别接种于培养基1（蛋白胨0.6%，酵母膏1.2%，蔗糖2.4%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，饱和碳酸氢钠溶液调节pH值为6.5～7.0）和培养基2（蛋白胨0.6%，酵母粉1.2%，蔗糖2.4%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，饱和碳酸氢钠溶液调节pH值为6.5～7.0）中，于26.5℃进行发酵培养48h，分别收集菌丝体及上清液，于80℃烘干24h，测干重。结果见表1。

表1 培养基筛选结果Table 1 Result of screening medium

由表1可见，使用培养基1进行发酵培养猫棒束孢，其菌丝体及上清液得率均优于培养基2，这与酵母膏与酵母粉的成分不同有关。酵母粉没有经过分解，是酵母液体纯培养干燥后的一种性状，可以做为蛋白原料理解；而酵母膏的营养物质得到过分解，是酵母破壁以后除去酵母细胞壁以后的细胞内容物质，主要成分是氨基酸、肽、核甘酸、B族维生素等，再复配微量元素、P源等营养元物质而成，可按照微生物培养基的概念去理解。

2.2 培养基装量的选择

将猫棒束孢菌种接种于培养基1装量分别为1000mL、800mL、500mL、300mL的3000mL的三角瓶中，于26.5℃进行发酵培养48h，分别收集菌丝体及上清液，于80℃烘干24h，测干重。结果见表2。

表2 装量筛选结果Table 2 Effect of culture medium volume on Isaria felina production

由表2可见，培养基装量在500mL以上时，菌丝体及上清液的收率随着装量的增加反而降低，而培养基装量在500mL以下时，菌丝体及上清液的收率却随着装量的增加而增加。培养基装量为500mL时，菌丝体得率及上清液收率均最高，故采用500mL装量。

2.3 温度对工艺的影响

将猫棒束孢菌种接种于培养基1装量为500mL的300mL三角瓶中，分别于30℃、26.5℃、22℃下进行发酵培养48h，分别收集菌丝体及上清液，于80℃烘24h，测干重。结果见表3。

表3 温度筛选结果Table 3 Effect of culture temperature on Isaria felina production

由表3可见，在30℃和22℃时菌丝体生长较慢，甚至不生长，而在26.5℃时生长较佳，说明菌丝体的生长对环境要求较为严格，在高温和低温环境中不易生长。

2.4 发酵时间对工艺的影响

将猫棒束孢菌种接种于培养基1装量为500mL的3000mL三角瓶中，分别于26.5℃下发酵培养36h、48h、60h，收集菌丝体及上清液，于80℃烘24h，测干重。结果见表4。

表4 发酵时间筛选结果Table 4 Effect of culture time on Isaria felina production

由表4可见，发酵时间48h时，猫棒束孢菌丝体及上清液产率均较高，而发酵时为36h和60h时，猫棒束孢菌丝体及上清液产率均有所降低。

3 结论

经过对培养基、培养基装量、温度、发酵时间等因素的考察，我们确定了猫棒束孢最佳发酵工艺：培养基为蛋白胨0.6%，酵母膏1.2%，蔗糖2.4%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，饱和碳酸氢钠溶液调整pH值为6.5～7.0；培养基装量为500mL，发酵温度为26.5℃，发酵时间为48h。

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[3]DEFFIEUX G,MERLET D,BAUTER,et al.New insecticidal cyclodepsipeptides from the fungus Isaria felina.II.Structure elucidation of isariins B,Cand D[J].J Antibiot，1981，34（10）：1266-1270.

[4]IKUMOTOT,SASAKIS,NAMBA H,et al.Physiologically activecompounds in the extracts from Tochukaso and cultured mycelia ofCordycepsandIsaria[J].Yakugaku Zasshi，1991，111（9）：504-509.

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[8]陈孝文，梁 东，刘华锋.慢性肾功能衰竭[M].第一版.北京：中国医药科技出版社，2006：280.