手足口病的实验室诊断

刘艳红，李咏梅

(1淄博齐都医院，山东淄博 255400;2淄博市临淄区人民医院)

手足口病传染性强，传播途径复杂，传播速度快，短期内即可造成大流行。我国卫生部于2008年5月起将其列为丙类传染病。实验室检查为手足口病的主要诊断方法，现概述如下。

手足口病病毒的特征:手足口病的病原体属于小RNA病毒科肠道病毒属，包括柯萨奇病毒A组(CoxA)的 2、4、5、7、9、10、16 型，B 组(CoxB)的 1、2、3、4、5 型，肠道病毒 71 型(EV71)，埃可病毒(ECHO)等;以EV71和CAV16型最为常见。病毒无包膜，湿、热条件适宜生存及传播，4℃可存活1 a，－20℃可长期保持感染性。病毒对紫外线及干燥敏感，各种氧化剂(高锰酸钾、漂白粉等)、甲醛或56℃、30 min均能将其灭活;但其对乙醚、75%乙醇、表面活性剂等均不敏感。

手足口病的实验室诊断方法:实验室确诊手足口病的标准为从疑似患者的各种分泌物、体液及组织中分离出肠道病毒和检测到病毒的特异性核酸;血清标本中检测到人肠道病毒的特异性中和抗体滴度≥1∶256;或急性期与恢复期血清中肠道病毒特异性抗体有4倍或4倍以上升高。主要方法:①病毒分离。粪便标本是最常采集的标本，其他包括咽拭子或咽喉洗液、脑脊液、疱疹液或血清以及脑、肺、脾、淋巴结等组织标本。病毒分离培养对流行病学分析具有重要意义，但分离耗时(4～5 d)。病毒分离培养对技术要求较高，费用较贵，时间长，不适用于流行期间同时处理大量样本。②血清学检测。主要包括ELISA、中和抗体试验、补体结合试验(CF)。手足口病爆发流行时血清学检测不易区分EV71和CoxA16，只能通过核苷酸序列测定进行区分。ELISA法:主要用于检测病毒IgM和IgG抗体。特点是快速、经济、对实验室要求不高。检测人双份血清标本的中和抗体滴度时通常需用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度≥4倍增高证明病毒感染。因病毒感染后出现抗体需要一定时间，故ELISA法的早期诊断灵敏度不高。生物素—亲和素酶联免疫(BA-ELISA)法以抗EV71抗体为包被抗体，灵敏度、特异性、准确性及精密性均较高。中和试验:指将健康人或患者血清与标准肠道病毒株或患者自身分离的病毒株中和，测定机体的抗体水平。病毒感染后中和抗体在机体内存在时间较长，故该法是鉴定病毒的可靠方法，一定程度上还可反映机体的免疫力。如果中和实验中出现凝集，样本中有多个病毒会出现抗原漂移，影响抗原分型;接触病毒机会较多者亦容易出现抗体滴度的异常增高而混淆诊断。补体结合试验:补体结合抗体出现在感染早期，可鉴别近期感染或既往感染，由于血清与不同的EV型存在交叉反应，导致假阳性的结果相对较高。③聚合酶链式反应(PCR)。该技术几乎可检出病毒所有的血清型，与传统方法相比敏感性、特异性和检出率均较高。a转录—聚合酶链反应(RTPCR):检测时需将RNA逆转录为cDNA，再进行特异DNA序列的扩增和检测。该技术克服了病毒分离培养和血清学方法相对繁杂费时，且在病毒流行期间无法满足同时处理大量样本的缺点，是肠道病毒感染的快速诊断手段。但其检测周期，操作较复杂，结果判定过程复杂，反应产物污染率高。b实时荧光PCR:与常规PCR相比特异性强、自动化程度高、污染率低，目前为手足口病的首选检查方法。c内标多重荧光RT-PCR:该法结果可靠，能同时检测EV71和CoxA16且检出率明显高于传统方法。数据统计显示，该法存在假阴性现象，提示有传统PCR抑制物的存在。④基因芯片技术。该技术是将DNA片段高密度的固化到经特殊处理的载体表面，在特定条件下与荧光标记的样品分子进行杂交，然后通过显微或扫描技术收集杂交信号，并利用生物信息学软件对杂交结果进行分析，从而获得样品的遗传信息，主要优点是可以同时检测多段基因，灵敏度较高;应用多组探针联合判断检测结果可有效降低假阳性率。此外，因基因芯片本身具备高通量、大规模的特点，用于鉴别诊断最有优势，可将多种病原体点样到芯片上进行联合诊断，从而确诊及排除疑似患者。

总之，病毒分离鉴定及血清型分型是检测EV71和CoxA16的金标准，但病毒分离鉴定方法繁杂费时，血清学检测方法灵敏度不高。PCR法，尤其是多重荧光RT-PCR法灵敏度高，特异性好，可靠性强。