去卵巢对Wistar大鼠MSCs的形态学、生长曲线及骨/脂向分化能力的影响

王 艳，李遇伯，李 晶，周 鹏，毕月玲，陈学艳

(1.天津中医药大学中药学院 天津市中药化学与分析重点实验室，天津 300193；2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193)

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是在骨髓中发现的一种起源于中胚层，具有自我复制和多向分化潜能的非造血干细胞[1]。其在不同的诱导条件下,能分化成成骨细胞[2]、软骨细胞[3]、脂肪细胞[4]等中胚层组织。越来越多的研究发现各种原因(如衰老、骨质疏松)引起的骨量减少往往是和骨髓中的脂肪组织增多伴行的，因此人们开始关注MSCs参与的成骨减少和成脂肪增多所引起的骨质疏松[5]。本实验采用双侧卵巢切除法复制骨质疏松症(osteoporosis,OP)大鼠模型，比较了正常和OP大鼠MSCs的形态学、生长曲线、骨向和脂向分化能力的差异，从MSCs角度阐释OP后机体内的病理学变化，为以MSCs为平台，研究OP提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 6月龄雌性Wistar大鼠(中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供)。

1.2 主要试剂 α-MEM培养基(Gibeo)，胎牛血清(Hyclone)，胰蛋白酶、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、噻唑兰(MTT)(上海生工)，地塞米松、β-甘油磷酸钠、VitC、吲哚美辛、牛胰岛素、异丁基黄嘌呤(Sigma)，巴比妥钠、油红O染料(北京索莱宝)，Ficoll(GE Healthcare)。

1.3 诱导液配制

1.3.1 成脂诱导液 α-MEM+10 mL/dL胎牛血清(含100 U/mL青、链霉素)+10 μmol/L胰岛素+1 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/L异丁基黄嘌呤(IBMX)+100 μmol/L吲哚美辛。

1.3.2 成骨诱导液 α-MEM+10 mL/dL胎牛血清(含100 U/mL青、链霉素)+0.1 μmol/L地塞米松+10 mmol/L β-甘油磷酸钠+50 μmol/L维生素C。

1.3 主要仪器 CO2培养箱(Thermo)，TS100型倒置相差显微镜(NiKon)，超净工作台(苏州佳宝净化)，TECAN infinite M200型酶标仪(TECAN)。

2 方法

2.1 动物模型与分组 12只6月龄Wistar雌性大鼠随机分成模型组和假手术组，每组6只，模型组双侧卵巢切除法复制大鼠OP模型，假手术组大鼠找到卵巢后不切除。术后连续肌注青霉素3 d，5万U/只。普通饲料饲养，自由饮水，增龄3个月。

2.2 MSCs的分离与培养 大鼠麻醉后颈椎脱臼处死，无菌条件下剥离胫、股骨，用完全培养液反复冲洗骨髓腔，所得单细胞悬液接种于塑料培养瓶中培养。原代MSCs培养7～10 d后传代，之后培养3～5 d按1∶2比例传代。

2.3 MSCs细胞表面标志物的鉴定 取P3代MSCs，经0.25%胰酶+0.02%EDTA消化后，制成单细胞悬液。以3×104Cells/mL接种于6孔板中。2 d后取出，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，山羊血清37 ℃孵育30 min，加入一抗4 ℃孵育过夜，选用非相关IgG抗体作为阴性对照。PBS洗涤3次后，加入二抗37 ℃孵育60 min，PBS洗3次，SABC反应液37 ℃孵育60 min，PBS洗3次，DAB显色后立即于显微镜下观察。蒸馏水洗，苏木素复染，脱水，透明，封片。

2.4 正常与OP大鼠MSCs生物学特性的比较

2.4.1 形态学 采用倒置相差显微镜，观察并比较正常与OP大鼠MSCs的形态学差异。

2.4.2 MTT法检测生长曲线 分别取正常与OP大鼠P3代MSCs，以2.0×103cells/mL接种到96孔板中，每孔终体积200 μL，从接种后的第1天起进行MTT测定，每天测1板。均设6个复孔。各组同时培养达4 h后，测定各孔吸光度值。测量波长为570 nm。

2.5 有及无诱导条件下正常与OP大鼠MSCs多向分化能力的比较

2.5.1 分组 正常组(正常大鼠MSCs未加诱导条件)，OP组(OP大鼠MSCs未加诱导条件),正常诱导组[正常大鼠MSCs+成骨(成脂)诱导液]，OP诱导组[OP大鼠MSCs+成骨(成脂)诱导液]。

2.5.2 骨向分化ALP染色比较 正常及OP大鼠P3代MSCs分别以1×105Cells/mL接种于预先置有无菌盖玻片的6孔板中，按2.5.1分组，分别培养。14 d后取出相应玻片进行ALP染色，光镜下观察，比较。

2.5.3 脂向分化油红O染色比较 正常及OP大鼠P3代MSCs分别以1×105Cells/mL接种于预先置有无菌盖玻片的6孔板中，按2.5.1分组，分别培养。18 d后取出相应玻片进行油红O染色，光镜下观察，比较。

3 结果

3.1 免疫组化染色检测MSCs表面抗原 免疫组化染色鉴定结果显示MSCs细胞呈CD29、CD44阳性，胞浆染色呈棕黄色(图1、2)；CD34、CD45阴性(图3、4)。

图1 CD29

图2 CD44

图3 CD34

图4 CD45

3.2 正常与OP大鼠MSCs形态学观察 采用倒置相差显微镜观察2组细胞的生长状态,经传代，正常大鼠MSCs还呈比较典型的集落方式生长，细胞为长梭形(图5a)。而OP大鼠MSCs的增殖速度减慢，细胞形态宽大、扁平，可见少量脂肪细胞(图5b)。

3.3 正常与OP大鼠MSCs生长曲线 从图6可以看出，接种后所测得的生长曲线均呈S形。细胞接种后1～4 d OD值变化不大，到第4天OD值开始明显增加，OD值于第7天达到顶点，随后有减小的趋势。对比正常组与OP组大鼠MSCs生长曲线，二者增殖趋势基本相同，且符合细胞生长规律。但是在增殖能力上OP大鼠MSCs较正常组降低，经配对样本t检验，t=3.316，df=8，P=0.011<0.05，二者差异具有统计学意义。

图5a 正常大鼠P3代第5dMSCs(100×)

图5b OP大鼠P3代第5dMSCs(100×)

图6 正常与OP大鼠P3代MSCs生长曲线

3.4 骨向分化ALP染色比较 骨向诱导15d后运用钙钴法进行ALP染色，胞浆内呈现深棕色或深黑色颗粒状或大片状黑色沉淀，说明MSCs成功分化为OB。且正常诱导组ALP染色阳性细胞明显多于OP诱导组。结果如图7a、7b所示。

图7a 正常诱导组MSCs ALP染色(100×)

图7b OP诱导组MSCs ALP染色(100×)

3.5 脂向分化油红O染色比较 脂肪诱导第4天，细胞胞浆内开始出现细黄色小脂滴，逐渐融合，倒置显微镜下可见的高折光性的小圆形脂滴，晶莹透亮，主要集中于细胞核周围。随着诱导时间的延长，出现脂滴的细胞逐渐增多。继续诱导，胞内的小脂滴逐渐融合成大的脂滴，细胞体积逐渐增大，由原来的长梭形变为椭圆形或多角形，细胞核被被大颗粒状的脂滴挤于一侧。随着诱导时间的延长，脂肪细胞的比例逐渐增高。油红O染色显示脂滴呈红色，OP诱导组阳性数量明显多于正常诱导组，结果如图8a、8b所示。

图8a 正常诱导组MSCs油红O染色(200×)

图8b OP诱导组MSCs油红O染色(200×)

4 讨论

MSCs可以表达多种标记，但是缺乏特异性表面标记，目前尚无具有高度特异性的MSCs表面标记物，其鉴定的方法都是通过在培养过程中出现分化表型，然后逆推得知是否为MSCs。因此本实验选取MSCs表达阳性的指标CD29和CD44，以及表达阴性的指标CD34和CD45作为鉴定参考指标。本实验结果与报道一致，证明分离培养扩增的为大鼠MSCs[6]。

MSCs成骨分化的主要表现是细胞能够合成、分泌表达成骨特异性的蛋白和细胞外基质成分,包括早期出现的ALP,Ⅰ型胶原等。ALP是成骨的标志物之一，对它的测定可以反映细胞向成骨方向分化的程度。在基质开始钙化时成骨细胞的ALP活性最高，在钙化接近结束时,活性则最低，其活力在一定程度上反映成骨细胞的分化程度和功能状态。因此,ALP的活性可以代表成骨细胞的早期分化水平。其作用是水解有机磷酸盐释放出无机磷而作用于羟基磷灰石的形成，是骨形成所必需的酶，它代表着骨形成的状况，表明细胞分化的开始。

本研究结果表明，去卵巢对于大鼠MSCs形态及增殖能力均有一定的影响。正常大鼠MSCs呈典型的集落生长，细胞呈长梭形，传代后增殖能力较强；而去卵巢后MSCs体积较大，细胞偏圆形，增殖能力大大下降。OP大鼠在分离完股骨和胫骨后，用PBS冲洗骨髓腔时,冲出的液体可见大量的油脂浮于表面，可推测骨髓中脂肪含量较高。在相同条件诱导下，OP大鼠MSCs更倾向于向脂肪细胞分化，而正常细胞则更多向成骨细胞分化。 综上所述，可初步推测去卵巢，增龄会导致骨髓腔内脂肪组织增多，骨组织减少，从而造成骨质疏松。

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