HPLC法测定腰腿痛宁中柚皮苷的含量

闻 辉，李晓春，王 沛,李雪婷,赵文海

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

腰腿痛宁是长春中医药大学附属医院应用多年的协定处方，由骨碎补、鹿角霜、熟地黄、北黄芪、狗脊、当归等10几味名贵中药组成，具有补肾强筋壮骨之功效，临床疗效确切。为将其由医院制剂室的协定处方开发成为新药面世，特制定如下控制该制剂质量的标准及方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪Waters 600，美国沃特世公司；超声波清洗仪KQ-DB-3200，昆山市仪器厂；旋转蒸发仪R-202，上海申花生物科技公司；SHB-3型循环多用真空泵，郑州市杜甫仪器有限公司；AL-204型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 药品与试剂 柚皮苷对照品，中国药品生物制品检定所，批号：110722-200611；腰腿痛宁制剂，由长春中医药大学附属医院制剂室提供(批号分别为110301、110303、110401、110402、110403、110404)；阴性对照品，由本研究室自制；甲醇、色谱纯(西陇化工股份有限公司)，水(杭州娃哈哈纯净水)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱分析 色谱柱：Autanlit C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇-磷酸溶液(0.10 mol/L)20∶80；流速：1.0 mL/min ；检测波长：283 nm；柱温：22 ℃；进样量：20 μL。

2.2 样品溶液的制备 取腰腿痛宁制剂约2 g，精密称定，加甲醇50 mL，加热回流4 h,放冷，滤过，滤液置于50 mL容量瓶中，用少量甲醇分次洗涤容器，洗液滤入同一量瓶中,加甲醇定容至刻度[1]，摇匀，用0.45 μm 微膜滤过，取滤液，作为制剂样品供试品[2]。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取经80 ℃干燥至恒重的柚皮苷对照品4.300 mg，置于100 mL容量瓶中，用色谱纯甲醇溶解，并加至刻线，摇匀,即得(每1 mL中含柚皮苷对照品0.043 0 mg)。

2.4 阴性对照品溶液制备 按处方比例称取除骨碎补外的其他药物，按腰腿痛宁制剂制法制成的阴性对照品制剂，再按2.2项下方法制备阴性对照品。

2.5 系统适应性试验 分别取标准品溶液、样品溶液、阴性对照品溶液按2.1项下色谱条件下进行分析,理论塔板数不低于4 000，阴性对照对供试品测定无干扰，色谱图见图1。

2.6 标准曲线的制备 精密吸取2.3项下柚皮苷对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，分别精密吸取20 μL进样。 以柚皮苷对照品进样量为横坐标，柚皮苷峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为：Y=1 627 809.246 5X+161 87.282 5，r=0.999 8(n=6)。

结果表明，柚皮苷在0.086 0～0.532 1 μg之间与峰面积呈良好线性关系。

2.7 精密度实验 精密吸取2.3项下的柚皮苷对照品溶液6分，每分4.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，分别精密吸取20 μL进样，测定色谱峰面积。计算得柚皮苷对照品的平均峰面积为577 287.912，RSD值为0.064 9%，结果表明该实验有良好的精密度。

2.8 稳定性实验 取供试样品适量,精密称定，依照样品溶液制备方法制备制剂样品溶液，室温(25 ℃)下放置0、2、4、8、16 h时，分别测定各样品的峰面积，结果所取供试样品平均峰面积为677 217.293，RSD值为1.98%。峰面积无明显变化，说明此时间内，供试样品溶液化学性质稳定。

2.9 样品测定 分别取腰腿痛宁成品6批(110301、110303、110401、110402、110403、110404)适量，按2.2项下操作制备供试品溶液，再按上述色谱条件进行分析，根据外标法测定面积并计算柚皮苷含量，见表1。结果符合所拟定的含量波动范围(95%～105%)。

a.标准品液相图谱

b.样品液相图谱

c.阴性对照液相图谱

表1 腰腿痛宁中的柚皮苷含量(n=5)

2.10 回收率试验 采用加样回收法，分别取已知含量的样品5分，精密称定，按2.2项下操作制备样品溶液，置于50 mL容量瓶中，再分别精密加入2.3项下的对照品溶液4 mL，甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微膜滤过，取滤液，分别吸取20 μL进样测定色谱峰峰面积。结果加样平均回收率为100.02%，RSD值为0.158 3%。

3 讨论

3.1 控制指标的选择 骨碎补为方中主药，是骨伤科常用中药，具有补肾强骨、续伤止痛功效。骨碎补主要含有二氢黄酮、黄烷-3-醇及其衍生物、二聚物和三聚物类、三萜、酚酸、原儿茶酸等多种化学成分，其中二氢黄酮(以柚皮苷为代表)是其主要活性成分，有促进骨折愈合、防治骨质疏松、抗氧化、调血脂、抗炎、镇痛等生物活性[2-4]。所以选择控制骨碎补中的柚皮苷含量为该中药复方的质量指标。

3.2 色谱条件的选择 本实验测定方法采用的色谱条件是根据上述样品的溶解性，并参考相应的文献[5-9],经逐步实验考察，同时考虑到今后的规模化生产状况成本而定。

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