福建汉族人胰岛素样生长因子受体基因多态性与非小细胞肺癌易感性的研究*

李鸿茹 陈愉生 邵 慧 韩莉莉 张祥娥



福建汉族人胰岛素样生长因子受体基因多态性与非小细胞肺癌易感性的研究*

李鸿茹1陈愉生1邵 慧1韩莉莉2张祥娥1

1.福建医科大学省立临床医学院呼吸内科；2.福建省心血管重点实验室

：探讨胰岛素样生长因子受体（IGF-1R）基因多态性与福建汉族人非小细胞肺癌（NSCLC）易感性的关系。：应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和DNA测序方法检测福建籍汉族NSCLC患者260例和健康人258例的IGF-1R+1013和IGF-2R+1619两个位点的等位基因分布，探讨不同基因型与NSCLC发病的关系。：IGF-1R+1013（G/A）基因型和各等位基因的频率在两组中分布有显著性差异（< 0.05），与GG基因型者相比，GA、AA基因型者NSCLC患病风险均显著增加（< 0.05），未发现IGF-2R+1619（G/A）位点各基因型和等位基因的频率分布在两组中的差异有统计学意义（> 0.05）。根据病理类型分层分析发现，IGF-1R+1013（G/A）变异等位基因A携带者（GA+AA）患肺鳞癌、腺癌、其他类型肺癌的风险增加2.20倍、0.55倍、0.96倍（< 0.05）。未发现IGF-1R+1013、IGF-2R+1619两基因多态性与临床分期、淋巴结转移、远处转移有关（＞0.05）。两基因多态性的联合分析显示，同时携带IGF-1R+1013（G/A）和IGF-2R+1619（G/A）A等位基因者NSCLC的患病风险增加（= 0.003）。：IGF-1R+1013（G/A）中，变异等位基因A是肺癌发生的危险因素，IGF-1R+1013（G/A）和IGF-2R+1619（G/A）基因多态性对肺癌的易感性有协同作用。

IGF-1R IGF-2R 基因多态性 非小细胞肺癌

目前，肺癌已成为发病率、死亡率最高的恶性肿瘤之一[1]。IGF-1R+1013（G/A）和IGF-2R+1619（G/A）是目前研究最多的且与肿瘤发生密切相关的两个单核苷酸多态性(SNP)位点[2]，但迄今在中国人群中，该两位点基因多态性未见报道。本文分析了福建地区汉族人群这两个位点的单核苷酸多态性，以探讨其与NSCLC发病的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。肺癌血清标本来自于2010年10月～2011年6月经病理确诊的260例NSCLC患者，其中男性173例，女性87例，男女比例约2 : 1，年龄范围35～93岁，平均年龄61.1岁；258例自愿参加的健康人群血清作为对照组，其中男性171例，女性87例，年龄范围为39～90岁，平均年龄58.24岁，两组性别、年龄无统计学差异。纳入标准: ①每份样品均为3代以内无异族通婚史且无亲缘关系的血液标本，并与受检者签署知情同意书。②对照组均无其他部位原发肿瘤。③所有病例与对照均为居住在当地20年以上的汉族常住人口。收集病例组研究对象的组织类型、TNM分期等临床特征，TNM分期采用UICC第七版肿瘤分期，组织类型根据2004年WHO公布的“肺及胸膜肿瘤组织学分类修订方案”进行分型，将大细胞肺癌和未分化及未定性肺癌统称为其他型肺癌。

1.1.2 试剂。人血液基因组DNA提取试剂盒购自厦门泰京生物技术有限公司，PCR反应试剂购自大连宝生物工程有限公司，MnlI、NciI限制性内切酶购自Fermentas公司，PCR扩增引物由上海生工生物有限公司设计合成。

1.1.3 仪器。PCR仪（德国EPPENDORF），VDS-CL凝胶成像系统（瑞典PHARMACZA，JS-680D），紫外分光分度计(BECKMAN，DU-640)，琼脂糖电泳仪（北京仪器厂），低温度高速离心机（力新仪器上海有限公司），恒温水浴箱（新康器械）。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA的提取。抽取每个研究对象外周肘静脉血5mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，紫外分光分度计对DNA的浓度和纯度进行检测，纯度保证( 260 nm/280 nm) OD 值在1. 8~ 2. 0 之间。DNA置-20℃低温冰箱保存备用。

1.2.2聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。设计引物如下： G→A(Glu 1013 Glu)（SNP No：rs2229765），sense primer：5’-CAGGGGTCGTTTGGGATGGTC-3’,anti sense primer 5’-CCTGTGCTGCATTTTGGCTTTTC-3，以MnlI酶切可得到不同的基因多态性片段分别为：GG: 103、84 bp；GA: 103、84、123bp；AA: 84、123bp。G→A(Gly 1619 Arg) （SNP No：rs629849），sense primer：5’-AACAATGGTTAA- AGCCGGATTG-3’,anti sense primer ：5’-GGCCCGGGTGC- AGCCAGGCACTG-3’，以NciI酶切可得到不同的基因多态性片段分别为：GG: 307、149 bp；GA: 456、307、149 bp；AA: 456bp。PCR扩增体系（25uL）含0.4umol/L上下游引物，0.02mmol/L dNTPs，1.25U TaKaRaTaq酶，1×PCR buffer， 100ngDNA模板，加蒸馏水至25ul。IGF-1R反应条件为：94℃变性20 s，54℃退火20 s，72℃延伸30s；共36个循环，末次循环后，72℃再延伸10 min，产物为207bp。IGF-2R反应条件为：94℃变性30 s，67℃退火60 s，72℃延伸30 s；共30个循环，末次循环后，72℃再延伸15 min，产物为456bp，以蒸馏水替代模板DNA 作为阴性对照。取10uL PCR反应产物、1U限制性内切酶，2uL 10×buffer tango，18uL无菌去离子水，37 ℃水浴过夜。取5uL酶切产物经3 g/L琼脂糖凝胶电泳, 100 V 20 min，凝胶成像系统显影，随机抽取10%的DNA 标本进行重复实验。

1.2.3 DNA测序。取50μL PCR产物连同其上游引物由英潍捷基贸易有限公司,采用双脱氧法在ABI_3730XL 测序仪上进行单向测序。DNA测序图谱中，SNP位点只有一个峰G或A，表明是纯合子GG或AA型，SNP位点出现两个峰，表明是杂合子GA型。随机选择5% 样本进行DNA 测序, 测序得到的基因型与采用PCR-RFLP 方法得到的基因型完全相同（图1、图2）。

①: IGF-1R PCR产物经限制性内切酶MnlI消化后的电泳图. M: marker；1泳道：GG型；3泳道：AA型；2，4泳道：GA型； 5泳道：阴性对照；②: IGF-1R+1013多态性位点测序图。

图1 IGF-1R+1013（G/A）琼脂糖电泳及测序结果

①: IGF-1R PCR产物经限制性内切酶NciI消化后的电泳图. M: marker；3泳道：GG型；2泳道：AA型；1，4泳道：GA型； 5泳道：阴性对照； ②: IGF-1R+1619多态性位点测序图。

图2 IGF-1R+1619（G/A）琼脂糖电泳及测序结果

1.3 统计学分析

采用SPSS 18. 0 软件，以χ检验比较各基因型及等位基因在病例组与对照组分布的差异,多因素Logistic regression方法统计比值比(odds ratio，OR)和95％可信区间(confidence interval，CI)，且经性别、年龄等混杂因素校正。Spearman 等级相关分析基因型与肺癌分化程度、原发肿瘤TNM分期、远处转移、临床分期的线性关系，双侧<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 IGF-1R+1013（G/A）和IGF-2R+1619（G/A）基因多态性与肺癌患病风险的关系

两个位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(>0.05)。病例组中IGF-1R+1013(G/A)位点的GG、GA、AA基因型和等位基因A携带者（GA+AA）的频率分别为34.6%、53.1%、12.3%和65.4%，对照组的频率分别为51.2%、43.8%、5.0%和48.8%，两组中各个频率的差异均有统计学意义（<0.05）。与IGF-1R+1013(G/A) GG基因型携带者相比，GA型携带者的患病风险增加0.80倍(95%CI：1.24～2.59，=0.002)， AA型携带者的患病风险增加2.59倍(95%CI：1.78～7.26，=0.000)，而等位基因A（GA+AA）携带者的患病风险增加0.98倍(95%CI：1.39～2.83，=0.000)。IGF-2R+1619(G/A)各基因型和等位基因的频率分布在两组中的差异无统计学意义（>0.05）。详见表1。

表1 IGF-1R+1013(G/A)、IGF-2R+1619(G/A)基因型及等位基因频率分布与肺癌的患病风险的相关性

2.2 IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2R+1619(G/A)基因多态性与肺癌患者临床特征之间的关系

根据肺癌病理类型进行的分层分析发现，与IGF-1R+ 1013(G/A) GG基因型携带者相比，IGF-1R+1013(G/A)的变异等位基因A携带者(GA+AA)患肺鳞癌的风险增加2.20倍(95% CI: 1.75～5.84，=0.000)，患肺腺癌的风险增加0.55倍(95% CI: 1.00～2.41，=0.049)，患大细胞肺癌、未定性肺癌等其他型肺癌的风险增加0.96倍(95% CI: 1.10～3.49，=0.023)。IGF-2R+1619(G/A)基因多态性与病理类型无关（＞0.05）（见表2）；Spearman 等级相关分析基因突变与肺癌患者临床特征之间的线性关系未发现IGF-2R+1013(G/A)和IGF-2R+1619(G / A)基因多态性与临床分期、淋巴结转移、远处转移有关（＞0.05），IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2R+1619(G/A)基因的突变率并未随着肿瘤的T N M分期等的增加而增加（＞0.05）（见表3）。

表2 IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2R+1619(G/A)基因多态性与肺癌癌病理类型的关系

注: 其他类型包括大细胞癌、未分化及未定性肺癌。

表3 IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2R+1619(G/A)基因型与肺癌患者临床特征之间的关系

2.3 IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2R+1619(G/A)基因多态性的联合作用

表4进一步分析了IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2R+ 1619(G/A)各种基因型组合与肺癌的关系。结果显示，与同时携带这两个基因的GG基因型的个体相比，携带IGF-1R +1013(G/A)的GA基因型和IGF-2R+1619(G/A)的GA基因型的个体患肺癌的危险性增加1.05倍(95% CI: 1.18～3.57，=0.011)，携带IGF-1R+1013(G/A)的AA基因型和IGF-2R+ 1619(G/A)的GG基因型的个体患肺癌的危险性增加1.86倍(95% CI: 1.17～7.03，=0.022)，携带IGF-1R+1013(G/A)的AA基因型和IGF-2R+1619(G/A)的GA基因型的个体患肺癌的危险性增加3.54倍(95% CI: 1.41～14.60，=0.011)，肺癌组中未检测到同时携带IGF-1R+1013(G/A)的AA基因型和IGF-2R+1619(G/A)的AA基因型的患者，两基因联合多态性与NSCLC的易感性有关（=0.004）。

表4 IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2R+1619(G/A)联合作用与肺癌易感性的关系

3 讨论

基因定位于15q25-26，全长约100 kb，有21个外显子。IGF-1R蛋白是一种酪氨酸激酶跨膜蛋白受体，由两个a-亚基(130-135KDa)和两个β亚基(90-95KDa)通过二硫键结合而形成四聚体(α2β2), 与细胞外配体结合后，通过Ras/Raf/MEK/ERK 和PI3K/AKT两条信号传导通路促进细胞存活及抗细胞凋亡的作用[3]。IGF-1R主要与IGF-1、IGF-2和胰岛素相结合，研究表明，IGF-1R在包括肺癌在内的多种肿瘤中高表达[4]，并与肿瘤的分化程度相关[5-6]，16外显子上第1013编码谷氨酸的密码子出现G→A的突变（突变率0.49）与血清中IGF-1水平及人类寿命有关[7]。本研究发现，IGF-1R +1013(G/A)携带A变异等位基因的基因型(GA+AA) 在NSCLC组的频率显著高于对照组的，提示该位点A变异等位基因是肺癌发生的危险因素，这与MacDonald K等在食管癌的研究结果一致[8]。但G-A等位基因突变如何导致氨基酸合成改变进而影响蛋白质功能，使肺癌发生风险增加的具体作用机制有待进一步深入研究。

基因定位于6q26，约136kb，含有48个外显子，其编码的蛋白质是一个无内在催化活性的跨膜糖蛋白,与IGF-2配体结合后不能传导信号反而加速IGF-2的降解，目前认为IGF-2R对IGF信号转导通路所起的作用很可能是负向调节性的。IGF-2R基因座位有高频率的杂合性缺失(LOH)，并且在相当比例的等位基因中存在点突变[9]。Savag1[10]等报道，IGF2R基因内多个SNP与骨肉瘤的发病风险有关。IGF-2R的转录区1619位点G→A的突变造成IGF-2R结合域中甘氨酸被精氨酸替代进而影响了IGF-2对IGF-2R结合的亲和力，IGF-2基因+3580位点AA纯合突变和IGF - 2R的野生纯合型GG的组合对肝癌发生有保护作用[2]。Pavel检测到肺鳞癌IGF-2R基因发生了突变，认为IGF-2R 3’非翻译区短串联重复序列的基因突变可降低转录的稳定性[11]，与非小细胞肺癌的进展有关。本研究未发现IGF-2R+1619(G/A)基因多态性与肺癌易感性有关（＞0.05），但分析两基因多态性联合作用发现IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2R+1619(G/A)基因多态性对肺癌的易感性有协同作用。由于IGF-1R+1013 (G/A)变异等位基因A可能掩盖IGF-2R+1619(G/A)基因多态性在肺癌发生中的作用，尚不能认为IGF-2R+1619(G/A)基因多态性与肺癌易感性有关。

综上所述，IGF-1R基因1013密码子的突变与肺癌易感性相关，提示胰岛素样生长因子轴（IGFs）在肺癌分子发病机制中可能起重要作用，但具体作用机制有待进一步深入研究。

致谢：感谢福州市肺科医院在标本收集方面给予的帮助！

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福建省自然科学基金(NO：2011J01130 )，福建省卫生厅青年科研基金（NO.2010-2-7）。

李鸿茹，Email：muzi131122@163.com