白花蛇舌草乙醇提取物对人结肠癌HT-29细胞增殖及Hedgehog信号传导通路表达的影响*

叶 榕 林久茂 魏丽慧 庄群川 赵锦燕 彭 军



白花蛇舌草乙醇提取物对人结肠癌HT-29细胞增殖及Hedgehog信号传导通路表达的影响*

叶 榕1林久茂2魏丽慧2庄群川2赵锦燕2彭 军2＊

1.福建省卫生职业技术学院医学基础部；2.福建中医药大学医学实验中心

：观察白花蛇舌草乙醇提取物对人结肠癌HT-29细胞增殖及Hedgehog信号传导通路表达的影响。：采用人结肠癌细胞HT-29常规体外培养，随机设定空白组和不同浓度(1、3、5mg/mL)白花蛇舌草乙醇提取物组，干预24h，倒置显微镜观察细胞形态变化；MTT法测定不同浓度药物对HT-29细胞增殖的影响；RT-PCR检测药物作用后HT-29细胞Shh、Ptch、Smo和Gli-1 mRNA的表达。：白花蛇舌草乙醇提取物干预后，能抑制HT-29细胞增殖，并呈现出量效作用；Shh、Ptch、Smo和Gli-1 mRNA表达随药物浓度的增加而减少。：白花蛇舌草乙醇提取物能抑制HT-29细胞与其可抑制Shh、Ptch、Smo和Gli-1的表达有关。

白花蛇舌草 结肠癌 HT-29 Hedgehog

癌的形成是一个多因素、多步骤的过程，它涉及到一系列原癌基因异常的激活以及抑癌基因突变导致的失活，进而引起一些信号传导通路的异常。目前已有研究显示，Hedgehog(HH)信号通路异常活化在许多肿瘤包括基底细胞癌、乳腺癌、前列腺癌和一些消化系统恶性肿瘤的发生发展过程都起了重要作用[1]。同时HH作为潜在治疗靶点为癌症治疗提供一个新机遇。

白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd)的全草，其主要化学成分有熊果酸、免疫多糖、乌索酸、白花蛇舌草素等[2]，具有增强免疫活性、抗氧化和抗肿瘤活性，现广泛用于治疗各种炎症和肿瘤[3]。本实验就白花蛇舌草乙醇提取物(EEHDW)对人结肠癌HT-29细胞增殖及HH信号通路相关因子mRNA表达的影响，为白花蛇舌草的深入研究和开发利用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 药物和细胞株

白花蛇舌草购自福建中医药大学国医堂医院，批号：09072201。结肠癌细胞株（HT-29）购自中南大学湘雅中心实验室。

1.2 试剂和仪器

RPMI1640培养基、胰蛋白酶（trypsin）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），Hyclone公司；四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）干粉，Sigma公司；RT试剂盒、PCR试剂盒、TRIzol，Promega公司；PCR Master Mix（2×），Fermentas公司；PCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

B-290型实验室小型喷雾干燥机，瑞士Buchi公司；ELX800酶标仪，BioTek公司；HF212UV二氧化碳培养箱，Heal Force；IX70荧光倒置相差显微镜，日本OLYMPUS；9600型PCR仪，美国PE公司；Gel DOC 2000型凝胶成像分析系统、APC 300型电泳仪、水平式电泳槽，美国Bio-Rad公司；DU-650型蛋白核酸分析仪，美国Beckman公司；5417R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司。

1.3 EEHDW的制备

白花蛇舌草全草，用10倍85%乙醇回流提取2次，合并后过滤，回收乙醇，滤液浓缩至相对密度1.05，经喷雾干燥得粉末。得到提取物用40%DMSO溶解，配制成0.4g/mL溶液，经高压灭菌后于4℃保存待用。

1.4 细胞培养

将人结肠癌细胞株HT-29置于含10%热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养液中，于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。

1.5 MTT法检测细胞增殖

取对数生长期的人结肠癌细胞HT-29，用0.25%胰酶消化并收集细胞。以RPMI1640培养液（含10%FBS）制成细胞悬液，进行细胞计数，调整细胞密度为1×105个/mL，接种于96孔培养板中，每孔100uL，常规培养24h，使细胞同步化。设EEHDW组(终浓度分别：1、3、5mg/mL)和对照组(直接加等体积的培养液)，各组的DMSO含量调整为一致，以上各组均设8个复孔。继续培养24h，吸弃各孔中的液体，每孔加入0.5mg/mL的MTT溶液100uL，37℃孵育4h，然后吸弃各孔中的液体，每孔加入DMSO 100uL，振荡混匀，室温放置10min，使结晶充分溶解并混匀，于全自动酶标仪570nm测定各组吸光度值(即A值)，并按下列公式计算增殖抑制率：抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。

1.6 细胞形态学观察

在倒置显微镜下观察EEHDW干预培养24h后的HT-29细胞形态变化并拍照。

1.7 mRNA表达分析

EEHDW对人结肠癌HT-29细胞HH信号通路相关因子Shh、Ptch、Smo和Gli-1的mRNA表达分析。

对数生长期的HT-29细胞经胰酶消化后，取2×105个细胞/孔，接种于6孔板，实验分为（0、1、3、5mg/mL）4组，24h后进行药物干预，继续培养24h。采用Invitrigen公司的TRIzol，按说明书进行操作。提取后的RNA经紫外线分光光度计进行纯度及浓度的测定。

取溶于DEPC水中的RNA 1µg，应用逆转录(RT)试剂盒进行逆转录反应。PCR反应体系(20μL体系)：cDNA 1μL，2×PCR Master Mix 10μL，上下游引物各0.4μL，加DEPC水至20μL，震荡混匀，12000转离心10s后，置PCR热循环仪扩增；扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，X℃退火30s,72℃延伸45s，反应35个循环，最后72℃延伸10min。PCR 产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，图像分析仪照相和分析结果，以GAPDH基因为内参(具体的退火温度及引物序列见表1)。

1.8 统计学处理

表1 PCR引物序列、退火温度及产物长度

2 结果

2.1 EEHDW对人结肠癌细胞HT-29增殖的影响

EEHDW对人结肠癌细胞HT-29增殖抑制作用随浓度的加大而增大，抑制作用呈量效关系(图1)。

图1 不同剂量EEHDW对HT-29的抑制作用

2.2 EEHDW对HT-29细胞形态的影响

倒置显微镜下观察，空白组HT-29细胞胞质均匀，核仁清楚，伸展性好，生长良好，形成贴壁的梭形细胞。随着EEHDW作用浓度的增加，可观察到细胞形态逐渐改变呈圆形，细胞数逐渐减少（图2）。

2.3 EEHDW对HT-29细胞HH信号通路相关因子mRNA表达的影响

HT-29细胞经不同浓度EEHDW处理24h后，EEHDW能明显下调Shh、Ptch、Smo和Gli-1的mRNA表达（表2、图3）。

A：对照组；B：1 mg/mL白花蛇舌草乙醇提取物组；C：3 mg/mL白花蛇舌草乙醇提取物组；D：5 mg/mL半枝莲乙醇提取物组。

表2 EEHDW对HT-29细胞HH信号通路相关因子mRNA表达的影响

注：与对照比较，*<0.01

图3 EEHDW对HT-29细胞HH信号通路相关因子mRNA表达的影响

3 讨论

结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率居恶性肿瘤的第4～6位，在世界范围内，以经济发达国家的发病率为高，可高达30～50/10万[4]。近20年来，随着生活习惯、饮食结构等因素的改变，我国结肠癌的发病率和死亡率亦呈逐年上升的趋势[5]。目前结肠癌的治疗，主要以手术为主的综合治疗，但其根治性手术切除后5年生存率仅为50%左右。术后复发和转移是其死亡的重要原因。因此术后配合以中医中药治疗，对延长患者生存期，降低复发、转移，减轻放化疗副反应，改善生存质量等均有重要意义[6]。已知，白花蛇舌草具有良好的抗肿瘤活性，广泛应用于多种肿瘤的临床治疗，并在对消化、呼吸、血液等系统的恶性肿瘤治疗中取得了较好的疗效。

HH信号通路首先在果蝇中发现，随后又在脊椎动物中被证实，是人类胚胎发育过程中调控细胞增殖和组织分化的重要信号通路。目前认为，该信号通路主要由Hh配体、两个膜受体Ptch、Smo及下游的转录因子Gli组成。Hedgehog基因在哺乳动物中有三种同源基因：Shh、Ihh和Dhh，其中Shh对哺乳动物的乳腺、前列腺、肺、毛发和神经系统等多器官的发育起重要作用[7]。PTCH和SMO是细胞膜上两种跨膜蛋白，在HH信号传递过程中起到受体的作用。Gli是HH通路末端的转录调控因子，脊椎动物存在三种Gli转录因子(Gli1、Gli2、Gli3)。Gli1是一种直接的转录激活因子，其激活调控发生在转录水平，其mRNA的表达水平是反映HH信号通路活性的一个可靠指标[8]。

HH信号通路成员基因的异常表达会启动靶基因转录，引起细胞异常分裂增殖，从而导致肿瘤形成[9]。HH信号通路参与多种恶性肿瘤的发生与演进，可能的致癌途径有两个：(1)通过配体Shh表达，内源性Shh过表达，并和受体Ptch结合，从而解除后者对下游因子Smo的抑制作用，促使全长的Gli进入核内启动靶基因；(2)Ptch和(或)Smo发生突变，导致下游信号传导调节失控，靶基因不断激活[10]。目前已有研究证实结直肠癌的发生与HH信号通路异常激活有关。ONISCU等[11]研究发现，正常结肠黏膜上均有Shh、Ptch、Smo的表达，而在增生性息肉、腺瘤、结肠腺癌中Shh、Ptch、Smo的表达水平明显升高，体外细胞培养实验外源性Shh能促进结肠上皮细胞增殖，而抗Shh抗体能抑制结肠上皮细胞增殖。DOUARD等[12]研究发现，86%结直肠癌病例的癌组织中存在Shh mRNA的过表达，Gli1的表达与Shh密切相关，外源性的Shh可以促进HT-29结肠癌细胞株增殖，抗Shh抗体可以抑制肿瘤细胞株的增殖。

本研究结果显示，不同浓度（1、3、5mg/mL）的EEHDW对体外培养的HT-29细胞的增殖均有抑制作用，药物作用效果具有较明显的量效关系。同时，我们还发现人结肠癌细胞HT-29经不同浓度EEHDW处理后，HH信号通路相关因子Shh、Ptch、Smo和Gli-1的mRNA表达随药物浓度的增加而逐渐减弱，说明白花蛇舌草可能通过抑制Shh、Ptch、Smo和Gli-1的表达，从而达到抑制结肠癌HT-29细胞增殖的功效。

[1] 李晓伟，刘炳亚．Hedgehog信号通路在肿瘤中作用的研究进展[J]．生命科学，2009，21(1)：116-119.

[2] Lin CC，Ng LT，Yang JJ．Antioxidant activity of extracts of peh-hue- juwa-chi-cao in a cell free system[J]．Am J Chin Med，2004，32(3)：339-349．

[3] 宋立人．中华本草[M]．第1版. 上海：上海科学技术出版社，1999．

[4] 刘清华，熊建明，周乐杜．大肠癌的综合治疗[J]．中华现代外科学杂志，2005，2(2)：129-132.

[5] 谢正勇，卿三华．结直肠癌发病率及解剖部位变化趋势[J]．世界华人消化杂志，2003，11(7): 1050

[6] 卢艳琳．中医药治疗大肠癌研究进展[J]．中医学报，2010，25(146)：28-30．

[7] McMahon AP. More surprises in the Hedgehog signaling pathway[J]. Cell，2000(100)：185-188.

[8] Osterlund T，Kogerman P．Hedgehog signaling：how to get from Smo to Ci and Gli[J].Trends Cell Biol，2006，16(4)：176-180．

[9] MuLlor JL，Sanchez P，RuiziAltabaA. Pathways and consequences：Hedgehog signaling in human disease[J].Trends Cell Biol，2002，12(12)：562-569.

[10] Berman DM，KarhadkarS，MaitraA，et al. Widespread requirement for Hedgehog ligand stimuLation in growth of digestive tract tumours[J].Nature，2003，425(6960)： 846-851.

[11] ONISCU A，JAMES R M，MORRIS R G. Expression of Sonic hedgehog pathway genes is altered in colonic neoplasia[J]. J Pathol，2004，203(4)：909-917.

[12] DOUARD R，MOUTEREAU S，PERNET P. Sonic Hedgehog-dependent proliferation in a series of patients with colorectal cancer[J].Surgery，2006，139(5)：665-670.

福建省自然科学基金（No.2010J01195）；福建省教育厅科学基金(No. JA10162)。

彭军。