全局调控基因对抗生素生物合成的影响

陈艳萍，赵春田，裘娟萍

(浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310014)

链霉菌是一类具有分枝状菌丝体的好氧性革兰氏阳性细菌，它们具有复杂的形态分化和次级代谢过程，能产生多种类型的具有重要应用价值的次级代谢产物。例如，用于抗家畜寄生虫及杀螨虫的阿维菌素 (avermectin)，防治西红柿青枯病的链霉素(streptomycin)，用于兽药的四环素 (tetracycline)，用于饲料添加剂的默诺霉素 (moenomycin)等。随着人们对药物需求的日益增加，链霉菌生产抗生素的研究也突显其重要性。在这些抗生素合成过程中存在庞大而复杂的调控系统:途径特异性调控因子主要参与特定的抗生素的生物合成过程;全局多效调控因子不仅调控多种抗生素的产生，还参与链霉菌的形态分化。

全局性调控基因一般位于抗生素生物合成基因簇之外，调控相应途径特异性基因的表达。相对于链霉菌次级代谢中的其他调控模式而言，全局调控是一种更为多样、普遍、复杂的调控模式。全局调控基因可以调控多条次级代谢途径，对磷酸盐或者氮源匮乏、细胞壁损坏、热休克、pH压力等环境和营养胁迫信号做出反应［1-2］。根据参与调控的基因的数量通常可以将全局调控基因分为孤立响应调控 (orphan response regulate)基因和双组分调控系统 (two-component systems，TCSs)基因。本文以链霉菌模式生物天蓝色链霉菌 (Streptomyces coelicolor)的全局调控基因为参考，就近年来链霉菌中抗生素生物合成全局调控的研究进展进行综述，为利用基因工程手段提高抗生素的产量或对其进行结构改造提供依据。

1 孤立响应调控基因

孤立响应调控基因通常为单个基因，调控抗生素的生物合成。目前所发现的孤立响应基因众多，本文主要对以下几种研究得比较清楚的孤立响应调控基因作详细介绍 (表1)。

1.1 atrA

2005年，Uguru 等［3］在 S.coelicolor A3(2)中发现一种新的TetR家族的ActⅡ-ORF4的激活因子，命名为atrA(actinorhodin-associated transcriptional regulator)。Hong 等［4］通过体外实验发现，atrA不仅可结合到 actⅡ-orf4的启动子区，还可结合到灰色链霉菌 (Streptomyces griseus)途径特异性调控基因 strR的启动子，将 atrA导入 S.griseus后可引起链霉素产量下降。Hirano等［5］发现S.griseus中atrA基因表达的AtrA蛋白在某些特定的培养条件下对链霉素的生物合成起正调控作用。最近，Chen等［6］在对阿维菌素的代谢途径进行研究时发现，其基因组上也存在单拷贝的atrA同源基因aveI，该基因被阻断后，阿维菌素的主要组分Bla的产量升高，而在 aveI的回复突变株中，Bla的产量与野生菌相比又明显下降，表明aveI对阿维菌素的生物合成起负调控作用;将aveI多拷贝质粒导入 S.coelicolor中，放线紫红素 (actinorhodin，Act)产量明显增加，说明 aveI对 S.coelicolor中Act的生物合成起正调控作用。李光伟等［7］在力达霉素 (lidamycin)产生菌球孢链霉菌 (Streptomyces globisporus)C-1027中克隆到atrA同源基因。综上所述，atrA因菌株培养条件不同或属间差异对抗生素的合成起正调控或负调控作用。

表1 链霉菌孤立调控基因及其功能

1.2 bldA

bldA基因又称“光秃”基因，是目前研究最透彻的形态分化调控基因之一，编码链霉菌基因组中唯一能有效识别稀有TTA密码的tRNA。bldA阻断突变菌株不能形成气生菌丝和孢子，而表现为“光秃”表型［8］，“光秃”基因的名字也由此得来。测序完成的S.coelicolor基因组显示，其中145个含有TTA密码子的基因作为bldA潜在靶基因，构成了由bldA控制的庞大而复杂的基因调控元，因此链霉菌中，bldA基因在多水平级联调控系统中发挥着重要作用。S.coelicolor Act生物合成途径中，bldA通过控制含TTA密码子的途径特异性调控基因actⅡ-orf4和抗生素产物输出调控基因 actⅡ-orf2的表达来调节抗生素合成［9］。依赖 bldA调控抗生素合成的现象在其他链霉菌中也普遍存在，如白黑链霉菌 (Streptomyces alboniger)、S.griseus和变铅青链霉菌 (Streptomyces lividans)也都存在bldA通过控制含TTA密码子基因表达来调节孢子产生和抗生素合成［10-11］。陶韦新等［12］通过阻断阿维链霉菌 (S.avermitilis)NRRL 8165中 bldA基因，发现突变株丧失合成阿维菌素的能力，提示阿维菌素的合成受bldA调控;由于阿维菌素生物合成基因簇中aveA3和aveR含有TTA密码子，推断其翻译可能受bldA的调控。

1.3 nsdA和nsdB

nsdA (negative regulator of streptomyces differenti-ation)基因是最早在 S.coelicolor中发现的一个全局性调控基因，含有三十四肽重复单位(tetratrico peptide repeat，TPR)结构，对其产孢、形态分化、抗生素的合成均有负调控作用。余贞等［13］进一步的研究发现，nsdA是保守存在于多种链霉菌中的全局性负调控基因，对链霉菌形态分化和抗生素的合成均具有负调节作用，阻断nsdA基因可大大提高抗生素产量。例如，S.coelicolor A3(2)中nsdA基因的阻断，引起Act、钙依赖性抗生素 (calcium-dependent antibiotic，CDA)和次甲霉素 (methylenomycin，Mmy)超量产生，且产孢量也是野生型的2倍;S.avermitilis NRRL 8165中，nsdA基因的阻断导致阿维菌素的产量提高了3～5倍;井冈霉素 (validamycin)产生菌吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)5008、盐霉素(salinomycin)产生菌白色链霉菌 (Streptomyces albus)和庆丰霉素 (qingfengmycin)产生菌庆丰链霉菌 (Streptomyces qingfengmyceticus)等多种链霉菌中也发现有nsdA同源基因;陈芬等［14］阻断肉桂地链霉菌 (Streptomyces cinnamoncnsis)中的nsdA基因后，莫能菌素 (monensin)的产量提高了2.7倍。郭锁莲等［15］等通过基因阻断冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)226541中的nsdA基因，发现米尔贝霉素 (milbemycins)和南昌霉素(nanchangmycin)的产量分别提高了1.5和9倍。nsdA的广泛存在为抗生素生产菌高产菌株的构建提供了新的靶标。

研究发现，同样来自于 S.coelicolor的 nsdB(SCO7252)也编码TPR结构的蛋白，阻断nsdB基因使菌株的Act和CDA产量均提高，但形态分化没有明显变化［16］。含有 TPR结构域蛋白的具体作用机制还不清楚，该蛋白是如何表达、如何影响别的基因以致最终影响到形态分化和次级代谢的，这些问题都尚未阐明，或许是一种影响链霉菌分化的新模式。

1.4 relA

在某些重要的营养成分缺乏 (如氨基酸)时，细菌对某些基因和酶的表达进行严谨控制，称为严谨反应 (stringent response)。严谨反应是细菌适应不利环境的一种调控方式。许多研究发现，严谨反应依赖于焦磷酸鸟苷酸 (p)ppGpp的瞬时增加，当空载的tRNA结合到核糖体的A位点时，四磷酸鸟苷酸合成酶基因relA编码的蛋白催化 (p)ppGpp合成，(p)ppGpp的合成增加激活抗生素的合成。在大肠杆菌 (Escherichia coli)中人们发现(p)ppGpp能够改变RNA聚合酶对σ因子的选择性，这说明了 (p)ppGpp调控的靶点是 RNA聚合酶。当RNA聚合酶β亚基利福平 (rifampicin)结合域上某个位点突变后， (p)ppGpp对抗生素合成的直接调控作用消失了，提示这个位点可能靠近或者就是 (p)ppGpp结合RNA聚合酶的位点［17］，(p)ppGpp结合RNA聚合酶后，使后者的构象改变利于抗生素合成基因簇的转录［18］。在链霉菌中，relA的敲除表现为氮源缺陷条件下抗生素合成的缺陷，研究也证实了 S.coelicolor中relA敲除突变株中抗生素合成基因转录水平下降，以及抗生素合成途径特异性调控基因actⅡ-orf4和redD的转录明显下调［19］。Gomez-Escribano 等［20］研究发现，阻断棒状链霉菌 (Streptomyces clavuligerus)relA基因，使其不能形成气生菌丝且不能产生孢子，克拉维酸 (clavulanic acid)和头霉素 C(cephamycinC)的产量显著增加。最近，Makitrynskyy等［21］将 S.coelicolor中 relA 基因导入加纳链霉菌 (Streptomyces ghanaensis)ATCC 14672中异源过量表达，发现默诺霉素产量增加了2倍。

1.5 rrdA

rrdA(regulator of redD)基因编码TetR家族蛋白，在 S.coelicolor中被发现，随后依次在 S.avermitilis、产二素链霉菌 (Streptomyces ambofaciens)ATCC 23877等链霉菌中发现有同源基因。S.coelicolor rrdA阻断突变株显示 Red产量增加而 Act产量降低，将 rrdA多拷贝质粒导入 S.coelicolor中过量表达导致Red产量大大降低而Act高产;反转录PCR显示RrdA通过阻遏redD mRNA的合成负调控Red的生物合成，但Act途径特异性调控基因actⅡ-orf4的转录水平没有发生变化，说明RrdA对Act在转录水平上没有起正调控作用，可能通过与Act和Red合成途径的共同前体竞争调控 Act的生物合成［22］。

1.6 sig6

链霉菌中的ECFσ因子能快速、准确地调控不同的压力应答调控子以适应复杂的环境。目前，仅有一部分ECFσ因子因其在形态分化和次级代谢的调控作用而被广泛关注［23-25］。sig6(SAV663)存在于 S.avermitilis中，编码 RNA聚合酶 ECFσ因子，敲除该基因后，阿维菌素的产量增加了2.0～2.7倍，但对S.avermitilis的生长和形态无明显影响;将含多拷贝sig6基因的质粒导入S.avermitilis野生菌株后，阿维菌素的产量降低。说明Sig6对S.avermitilis的阿维菌素起负调控作用［26］。RT-PCR分析证明，Sig6通过途径特异性调控基因aveR调控阿维菌素的生物合成，这为通过改变ECFσ因子的活力增加链霉菌抗生素的产量开辟途径。

1.7 ssgA

ssgA(sporulation-specific cell division)基因在S.coelicolor中过量表达导致 Red产量增加2～5倍，但Act的生物合成完全受阻［27］。S.coelicolor中Red生成的时间比 Act早，ssgA将 S.coelicolor的生理状态控制在Red生成期，阻止其进入Act生成期。因此，ssgA可能代表另外一种协调抗生素生物合成与营养生长的新的重要模式［28］。由于ssgA对一些抗生素生物合成的正调控作用，现被应用于工业生产菌株上，如van Wezel等［29］通过过量表达S.lividans中 ssgA基因，导致其次级代谢产物产量增加2.5倍，S.coelicolor中 ssgA过量表达导致Red产量增加近10倍。因此，ssgA的过量表达为抗生素高产菌株的构建提供一种有效途径。

1.8 wblA

wblA(WhiB-like transcription factor)基因首先于S.coelicolor中被发现，编码 WhiB家族蛋白的同源物。其过量表达抑制 Act、Red和 CDA的合成，且不能产生孢子［30-31］。Noh 等［32］利用种间DNA微矩阵分析 (Interspecies DNA Microarray Analysis)发现波赛链霉菌 (Streptomyces peucetius)中也存在 wblA基因 (wblAspe)。阻断 wblAspe导致阿霉素 (doxorubicin)道诺霉素 (doxorubucin)产量增加7倍。Rabyk等［33］在已测序的 S.ghanaensis中鉴定了 wblAgh基因，阻断该基因发现 S.ghanaensis气生菌丝不能产生孢子，且默诺霉素的产量增加了2.3倍，说明S.ghanaensis中的wblAgh基因和wblAsco、wblAspe一样，负调控抗生素的生物合成，且与形态分化有关。

2 双组分调控基因

在链霉菌中，双组分调控系统是一类非常重要的全局调控系统，参与胞内渗透压调节、新陈代谢、细胞生长及形态分化等多种生理代谢过程，尤其与链霉菌复杂的形态分化和抗生素合成的调控有着密切的关系。本文就以下4种双组分调控系统基因作详细介绍 (表2)。

表2 链霉菌中双组分调控系统基因及其功能

2.1 absA1-absA2

AbsA1-AbsA2(SCO3225-SCO3226)是S.coelicolor中研究得最为清楚的一对双组分调控系统。absA1-absA2基因位于钙依赖性抗生素(CDA)生物合成基因簇内部，敲除S.coelicolor中absA1和absA2基因，证明了AbsA双组分系统负调控Act、Red和CDA的合成［34］。转录分析显示，AbsA1-AbsA2主要是通过影响途径特异性调控基因actⅡ-orf4和redD的转录来调控Act和Red的合成。而对于CDA生物合成的调控，是通过调控与CDA生物合成相关的多肽合成酶的表达来实现。AbsA1感应外界环境变化并转为激酶形式，对自身保守的组氨酸残基磷酸化进行自体激活，然后将自身的磷酸基团转移到应答调节子AbsA2保守的天冬氨酸残基上，磷酸化的应答调节子AbsA2再有力地结合到DNA的结合位点调控转录。当外界信号消失或被降解，AbsA抑制被解除，AbsA1转变为磷酸酶形式，将AbsA2去磷酸化，抗生素合成基因表达［35］。将absA1的等位基因导入Streptomyces flavopersicus异源表达发现，抗菌类物质粉霉素(pulvomycin)的沉默基因被激活［36］。因此，AbsA双组分调控系统的多效调控被广泛应用于开发新的抗菌物质。

2.2 afsR-afsK

AfsR属于STAND家族蛋白，由afsR基因编码，N端有OmpR家族的两个特征结构域 (DNA结合结构域和转录激活结构域)，同时还含有结合ATP的保守motif，在其C端有TPR结构域。通过磷酸化信号转导作用，AfsR可以同时对多种抗生素的合成进行调控。AfsK与细胞膜连接，感应外界特定的环境信号，将自身苏氨酸和丝氨酸残基磷酸化，以增加其激酶活力［37］。细胞膜上被激活的AfsK催化磷酸化细胞质中AfsR的苏氨酸残基和丝氨酸残基，极大地增强了AfsR与DNA的结合能力［38］。AfsR-P结合到位于 afsR下游 afsS的启动子-35区域并激活它的转录，afsS编码由63个氨基酸组成的蛋白AfsS，以未知方式正调控途径特异性基因actⅡ-orf4、redD和cdaR，从而增加 Act、Red和CDA的产量［39-40］。afsR基因失活突变导致 S.coelicolor中 Act、CDA的产量明显下降，导入 S.lividans中能促进原本沉默的Act和Red的合成［41］。AfsK磷酸化AfsR的能力由afsK上游基因的编码产物KbpA调节，当KbpA与AfsK结合时，AfsK的激酶活力被抑制并阻止AfsR的磷酸化［42］。

在S.peucetius中也发现了AfsR的结构类似物AfsR-p，当其克隆到外源质粒上ermE启动子下游并导入S. peucetius、 S. lividans TK24、 S.clavuligerus、S.griseus表达时，相应的道诺霉素、Act、克拉维酸、链霉素分别提高了4倍、2.6倍、1.5 倍和略有提高［43］。

afsS启动子区是AfsR的结合位点，该位点同时又是一个潜在的 PHO box。凝胶迁移实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)和DNA足迹实验 (DNA footprinting assay)的结果验证了PhoP和AfsR在afsS基因启动子区的识别序列是重合的;体外结合试验证明了PhoP和AfsR竞争性结合afsS启动子区，AfsR同时能够结合PhoP调控的基因，如pstS和phoR/phoP的启动子区;报告基因 luxAB实验证实 PhoP可下调 afsS的表达，AfsR可下调 pstS和 phoR/phoP的表达［44］。这表明PhoP和AfsR这两个全局调控因子之间存在复杂的相互交叉作用。

2.3 cutS-cutR

CutS-CutR(SCO5863-SCO5862)是链霉菌中第1个被鉴定的双组分调控系统［45］。迄今为止，多种链霉菌中均有报道该双组分调控系统的存在。插入突变实验显示，CutR-CutS的基因阻断会引起S.lividans抗生素Act的过量生成;而当CutR-CutS在S.coelicolor中过量表达时，Act的生物合成明显被抑制，因此与AbsA1-AbsA2一样，CutR-CutS对抗生素Act的生物合成也起负调控作用［46］。

2.4 phoR-phoP

磷酸盐是活细胞的重要组成成分，其重要作用及其在自然界中的缺乏使得细菌进化出多种应对磷酸盐缺乏的机制，这些机制导致细菌能够适应贫磷酸盐的环境。能够响应磷酸盐浓度变化的蛋白共同组成一个家族，称为 Pho调控子 (phosphate regulon)，PhoR-PhoP及其所调控基因编码的产物均属于PHO调控子家族［47］。该调控子家族成员的序列具有共同特征，即在其启动子区有一个PHO box序列。低磷酸盐浓度一直被认为能够刺激抗生素和其他次级代谢物的产生，包括了链霉素、四环素等［48］。在 E.coli中低磷酸盐浓度传递的信号首先使得感应器激酶 (PhoR)自我磷酸化，然后PhoR又将这个磷酸基团传递到相应调控蛋白(PhoP)的一个N端天冬氨酸残基上，导致PhoP与其调控基因启动子的结合能力大大提高，增强了这些基因的转录表达，PhoP的结合位点一般就是PHO box序列。在S.lividans中敲除 PhoR-PhoP双组分系统基因的突变株表现出碱性磷酸酶 (AP)活性的降低和磷酸盐转运的减少，同时Act和Red的大量产生，且无论在高磷酸盐还是低磷酸盐情况下产生Act和Red的能力均高于野生型菌株，说明PhoR-PhoP双组分系统抑制了抗生素的产生［49］。

2.5 rapA1-rapA2

2007年，Lu等［50］在 S.coelicolor中发现了一新的TCS，命名为RapA1-RapA2(regulation of both actinorhodin and a typeⅠ polyketide)，调控 Act和Ⅰ型聚酮化合物的生物合成。敲除rapA1-rapA2基因后，其生长和形态与野生菌株M145相比没有差异，但是Act和Ⅰ型聚酮化合物的产量明显降低。其作用模式与absA1-absA2类似，通过影响途径特异性调控基因actⅡ-orf4和kasO的转录来调控Act和Ⅰ型聚酮化合物的合成，但其对Act和Ⅰ型聚酮化合物的调控可能代表 S.coelicolor中一种新的调控途径。

2.6 abrA1-abrA2

2011年，Yepes等［51］在 S.coelicolor M145 中发现一种新的双组分调控基因 abrA1-abrA2(antibiotic rugulator)，敲除该基因后，Act、Red和CDA的产量高于野生型菌株，且不产孢子，说明abrA1-abrA2负调控抗生素的生物合成和形态分化。

3 小结与展望

链霉菌抗生素生物合成全局调控的显著特点之一就是它的多样性和复杂性。不同的基因应答不同的环境、生理信号和一系列信号转导系统介导的外界压力。全局调控基因多效调控多种抗生素的生物合成，大部分是以层层级联的方式间接调控，只有AbsA1-AbsA2和rapA1-rapA2等少数效应因子直接作用于抗生素合成途径中的途径特异性调控基因。不同调控基因之间也存在着交叉作用，导致抗生素生物合成的调控网络更为复杂。要将复杂的调控网络研究透彻是一个巨大的工程。目前，全基因组测序、全基因组微距阵、蛋白质组学和基因表达的时间-空间分析的发展，为理清调控网络的复杂关系提供了有效的手段。

加强对农用抗生素生物合成全局调控的研究，将加速构建新农药产生菌或抗生素高产菌株的研究过程。默诺霉素作为动物生长促进剂而广泛应用于饲料添加剂，作者以relA和nsdA基因为研究对象，利用基因工程手段阻断这两个基因的编码，研究其对斑伯链霉菌 (Streptomyces bambergiensis)和加纳链霉菌 (Streptomyces ghanaensis)中默诺霉素的产量及形态分化的影响，为进一步阐明次级代谢和形态分化调控网络奠定一定基础。

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