紫外线诱变在青霉素G生产菌种中的应用

张翼飞

（哈药集团制药总厂 黑龙江 哈尔滨 150086）

在青霉素G发酵生产菌种的制备过程中，菌种诱变筛选往往由于细胞壁的存在而影响其对外界理化因子的敏感性，因而我们采用细胞脱壁后再进行紫外线诱变处理的方法，选育高产优质菌种，大大提高了菌种细胞的变异率，加快了高产特性菌株的筛选过程，实践证明该方法是行之有效的。

1 实验材料

1.1 菌株

产黄青霉菌618#

1.2 培养基[2]

（1）斜面培养基（%）

甘油 0.75；甘油蜜糖 0.75；酵母浸处粉 0.5；NaCL 1;Ca-SO40.025;部分微量元素；琼脂 2.7；pH 6.8

（2）菌丝培养基（%）

玉米浆 6.1；蔗糖 2.0；CaCO30.5（调 PH 后加入）；pH 5.8

（3）再生培养基（%）

NaNO30.3;MgSO4·7H2O 0.05;FeSO4·7H2O 0.001;KCL 0.05;KH2PO40.1;

葡萄糖 4；酵母膏 0.2；琼脂 2.7；pH 6.8（用稳定剂配制）

（4）稳定剂

0.7 M NaCL

（5）种瓶培养基

以蔗糖、玉米浆为主要碳、氮源，pH5.8

（6）发酵瓶培养基

以乳糖、玉米浆为主要碳、氮源，加无机盐类组成，pH5.9

1.3 酶

纤维素酶+cellulase R—10

2 实验方法

2.1 原生质体的制备

（1）菌体培养

将618#菌种新鲜斜面加入适量无菌水，刮下菌株孢子制成孢子悬液，经玻璃珠打散过滤后取1mL接种于40mL的菌丝培养液中，28℃，240rpm条件下培养36h，得到菌丝体。

（2）胞壁酶处理

用4层无菌纱布过滤收集菌丝体，无菌水洗2-3次，再用稳定剂洗两次，取1g左右的菌丝体悬浮于5mL稳定剂中，加入5mg纤维素酶和5mg cellulase R-10，30℃恒温水浴振荡摇床60rpm，1.5-2h，镜检有大量原生质体释放后，用200目尼绒网滤除菌丝碎片和未酶解的菌丝体，滤液经1000rpm离心5min，弃上清，加10mL稳定剂重复离心两次，加入5mL稳定剂悬浮原生质体，备用。

2.2 紫外线诱变处理原生质体

取原生质体悬浮液适量，进行紫外线（253.7nm）诱变处理，分别照射 25′′和 40′′。

2.3 高产菌株的检出

将处理后的原生质体悬浮液涂于再生培养基平皿中，t=25℃，Φ=45±5%，恒温培养7天。带菌落长出后，挑选结构紧密，形状规则的单菌落传斜面培养后，进行发酵摇瓶的筛选。

3 实验结果

3.1 紫外线对原生质体的致死作用

我们对产黄青霉菌618#进行了紫外线处理，并分别采用25′、40′的计量处理原生质体，由表1可以看出，随着照射时间的增加，致死率也相应提高。

表1 致死率

3.2 发酵相对效价与相对产量的变化

经摇瓶发酵筛选得到701#菌种，该菌种在发酵效价与总产量方面均高于出发菌株618#（表2）。

表2 两菌株发酵相对效价及相对产量

3.3 限氧条件下的摇瓶考查

用改变瓶口纱布层数来改变供氧的方法考查76#菌株在限氧条件下发酵效价的变化情况（表 3）。

由表3可以看出，随着纱布层数的增加、供氧量的减少，701#菌株的发酵效价变化不大。

表3 不同限氧条件下发酵效价变化

3.4 单位菌丝合成能力的比较

单位菌丝合成能力的比较是考查一个新菌株是否有推广生产价值的主要参数之一，为此我们将菌株701#和菌株618#进行了对比考查（表4）。

表4 两菌株单位菌丝合成能力比较

从表3可以看出701#菌株单位菌丝的青霉素合成能力明显高于618#菌株。

3.5 稳定性考查

将701#菌株传代后，进行摇瓶考查，结果表明其F1代、F2代、F3代发酵效价与总产量均无明显变化，说明该菌株的稳定性较好。

4 讨论

本试验采用的方法筛选青霉素高产菌株，试验证明，产黄青霉菌的细胞壁被去除后，对紫外线的敏感度增强，随着照射时间的增加，致死率相应提高，在引起绝大多数原生质体致死的同时，存活个体中的变异频率大大提高，处于对数生长期的菌丝体最容易酶解，通过摇瓶筛选我们得到701#菌株，该菌株除发酵效价和总产量有所提高外，对氧的需求也有所降低，取得了很好的效果。

［1］熊宗贵.发酵工艺与原理[M].中国科学技术出版社.

［2］翁艳军.青霉素产生菌的原生质体融合[J].中国抗生素杂志，2003，3：129-130.