流感病毒的实验室检测方法及进展探究

秦金勇

桂林市疾病预防控制中心，广西桂林 542500

流感病毒又称为：流行性感冒病毒，具有超强的传染性、散播性，是一种RNA病毒，归属于正黏液病毒科。一般通过呼吸道感染以及人类或动物的呼吸、讲话等途径进行传播。传播的效果极快，短时间内就可造成大面积的患有流行性感冒病毒的病例产生。流感病毒主要分为三个等级，即甲型、乙型、丙型。其中甲型流感病毒是一种急性的流感病毒，经过变异发展后对人类自身的伤害巨大，死亡率较高。流感病毒实验室的建立在于研究流感病毒，分析和总结出流感病毒的分布范围以及发展趋势，对我国预防和治疗流感性病毒具有至关重要的作用。

对此针对流感病毒实验室的检测方法具有十分重要的地位。笔者结合自身的工作经验，进行如下分析。

1 检测方法

1.1 流感病毒分离鉴定

流感病毒的分离鉴定方法主要有鸡胚接种和细胞培育两种方法，是流感病毒实验室最为常用的检测方法。结合实际的案例，对两种分离鉴定进行详尽阐述。

选取在2011—2012年间在该市各哨点监测医院就诊患有流感病毒的病例，采集病例的鼻、咽拭子，放置在事先配置好的Eaglecs的溶液中。将标本进行冷藏，送入流感病毒实验室。在实验室中将标本进行常规处理，并添加青霉素与链霉素保证标本的完整，易于试验。在处理后的2 h内，标本放置在低温冰箱中进行冷藏。冰箱的温度维持在-70℃左右。

①鸡胚接种法。在市场上选取9～11日龄的鸡胚和受精鸡蛋，进行鸡胚接种试验。在鸡胚的两个双腔中分别注入2 mL实验标本，每个标本分别注入三个鸡胚之中。完成接种的72 h，观察孵育情况，并维持温度在33～35℃之间。夜晚温度下降至4℃。于第2日，收集孵育鸡的羊水以及尿液。将收集的样本用吸管滴入血凝板中，加入1%的0型红细胞。对样本进行均匀摇晃，放入观察室中，进行观察。大约在30～60 min后，得出血球凝集效果，进行分析鉴定。根据结果所呈现的阴阳性进行不同处理。如结果呈现为阴性，就将羊水混合采取盲传一代。如结果呈现为阳性，将采取下一步的鉴定。

②细胞接种法。将选取的样本分别进行细胞接种，1样本/2接种。每个样本接种的容量为0.2 mL。将其放置在细胞中进行培育，温度维持在33～35℃之间，时间长度为2 h。通过观察发现细胞每天都会发生相应的病变，且逐渐加深。待病变显示为3—4加号的程度上，从中收取细胞溶液，将其放入冷藏冰箱，冰冻—融化反复2次。采取红细胞凝集实验，根据实验所呈现红细胞凝聚滴度，选择不同的处理方式。以1：8为标准，红细胞凝聚滴度＞1：8时，将细胞溶液进行稀释，稀释程度为1:10的比例。稀释完成后，进行传代处理；红细胞凝聚滴度＜1:8时，直接进行传代处理。最后进行鉴定，并将结果交至国家流感病毒控制中心。

这两种流感病毒分离鉴定方便各有利弊。鸡胚接种法操作简单、方便，且对病毒原体的要求度不高，检出效率较低；细胞培养法操作较难，花费时间较长，但检出效率较高。同时，两种分离鉴定方法的灵敏度好、特异性强，常用于流感病毒的分离检测之中。

1.2 免疫学检测方法

免疫学检测方法是依据免疫学的理论，对抗原、抗体、免疫细胞分子、分泌细胞因子进行检测的实验手段，广泛用于流感病毒的检测。一般针对抗体的检测，选择病例的血清样本；针对抗原的检测，选择病例的呼吸道溶液的样本。

①血清的检测。血清诊断主要用于抗体的检测，方法较多，如：血凝抑制方法、中和方法、酶免疫方法、补体结合方法等类型。我国普遍采取的血凝抑制方法进行动态的血清诊断，同时，针对双份血清可同时进行检验。如样本的特异性抗体表现为4倍以上增高，就可初步诊断为流感病毒。

②抗原的检测。抗原检测主要针对甲型流感病毒的检测，其中包含快速检测甲型流感病毒方法以及流感病毒斑点酶的吸附方法。快速检测甲型流感病毒方法强调的是根据病例的鼻、咽拭子的样本，利用金标记的免疫层分析方法，从中取病体抗原，进行详细检测。所需时间较短，仅需要30 min就可以确定流感病毒的类型。这是基于我国2009年大范围发生甲型流感病毒所从中研究得出的成果。同时，流感病毒斑点酶的吸附方法也广泛应用于对甲型流感的检测，主要利用甲型流感的两种抗体不同，将其分成检测抗体和捕获抗体，从中得出检测结果。

免疫学检测方法操作简单、灵敏度较高，特异功能强，具有广泛的应用性。但免疫学检测的方法对选取的样本要求较高，且分析的因素较多。

1.3 核酸检测方法

核酸检测主要指的是一种直接检测流感病毒病原体核酸状况的方法，这是基于不能检测抗体和抗原的基础上，所进行的一种急性检测。其中包括对核酸本身的提取、扩增以及检测。这种检测方法主要强调了对患者自身基因状况的检测。通过提取患者的基因，将利用引物以及相关的技术对所提取的基因进行复制和扩大。其中，引物专门指的是可能会发生突变以及可以对其识别的基因。根据基因序列诊断方法、酶切方法等方式对基因中的病毒组织和病毒结构进行判断，从而发现患者的血液里是否有病毒体的基因，进而判断流感病毒的类型以及发病程度。其中，检测方法主要有基因测序方法、逆转录PCR、荧光定量PCR等。

核酸检测方法具有检测速度快，特异性强、敏感度高的特点，一般基于未能检测抗体和抗原的情况下。但是核酸检测方法对实验室的操作环境、操作设备以及操作人员的要求相对较高，这也决定了核酸检测所花费的成本较高，一般适合科研机构、卫生疾控系统及较大医院的流感病毒实验室的检测，对于较小医院还是采用以上的几种检测方法。

2 小结

随着我国医疗水平的不断提高，针对流感病毒的实验室检测技术也随之提高。其中，由鸡胚接种和细胞接种的病毒分离鉴定方法是我国目前最为常用的实验室检测手段，其操作简单，费用较低，灵敏度高，特异性强的特点受到了卫生疾控系统和各大中小医院流感病毒实验室的欢迎，是我国主流的检测技术。但对于急性流感病毒的检测具有一定程度的弊端，检测时间较长，影响检测的效果，从而延误了病情的诊断和治疗。免疫学检测方法正好弥补了这一缺陷，具有花费时间短、灵敏度高等特点，但其中分为血清和抗原两种检测手段，每种检测的方法的优缺点有所不同。血清检测时间短、快速便捷、灵敏度低；抗原检测灵敏度高、花费成本高。另外，核酸检测是针对缺乏抗体和抗原的情况下，针对基因的检测，但其高成本、高要求使得中小型医院望而却步。

通过以上几种检测方法的分析，我们看到了我国在流感病毒实验室的检测方法中逐步前进和发展，并取得了一定的成效，促进了我国对流感病毒的检测和管理，有利于分析流感趋势，预防流感发生，并真正将流感病毒的快速检测、型别的鉴定、流行趋势的分析等技术应用到流感的预防控制及患者治疗中，为广大患者尽快解决病痛，实现社会主义医疗事业的稳固发展。

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