血红素氧合酶－1与呼吸系统疾病＊

西安交通大学医学院第二附属医院呼吸内科（西安710004） 张德信 综述 李满祥 审校

对于血红素氧化酶（Hemeoxygenase，HO）的研究，最早可追溯到1968年。Tenhunen首次对其进行了描述。20世纪80年代中末期，在动物和人体的肝脏、脾脏、肺、脑和睾丸等组织中分离纯化获得HO及HO的同工酶。迄今为止，发现血红素有三种同工酶，HO－1、HO－2、HO－3。HO－1主要的功能是分解血红素，催化血红素生成一氧化碳（CO）、铁和胆绿素，具有高度可诱导性，高热、高氧、内毒素和炎性因子等多种刺激均可诱导其表达增加，参与抗炎、抑制细胞增殖及凋亡、扩张血管等各种保护性的生理过程。鉴于其上述多种生理功能，从分子生物学到基因表达调控，再到临床研究，特别是在呼吸系统的研究越来越广泛深入。

1 HO－1基因调控 人类HO－1基因长度大约有14kb，定位于染色体22q12，含有4个内含子，5个外显子。人、大鼠、小鼠和鸡HO－1基因的5＇端有相应的调节元件，包括应激反应元件、缺氧诱导反应元件、热休克反应元件和金属调节元件等。这些调节元件位于启动子上游的近端增强子附近，以及转录起始位点上游4kb和10kb处的多个远端增强子的附近。转录因子与这些特殊元件结合可使HO－1基因表达。转录因子主要包括 Nrf2、AP－1家 族 （c－fos、c－jun和jun－B 等）、核 因 子－κB、cAMP／cGMP应答元件结合蛋白（CREB）和Ets家族等。目前研究最多的转录因子是Nrf2。他可以上调HO－1的基因表达，是抗氧化应激的重要转录调控因子。Bach1与Nrf2竞争性结合 Maf蛋白识别元件（MAREs），下调 HO－1的基因表达［1］。

2 作用机制 HO－1在体内的生物活性是通过其催化底物的代谢产物发挥作用的。其催化血红素降解的主要产物是CO、胆红素和铁，它们均是重要的生 物效应分子［2］。HO－1在体内是通过这些效应分子发挥抗氧化、抗炎、抗凋亡等生理作用。

正常生理条件下，体内氧自由基的产生和清除保持平衡。这种平衡一旦因为某种致病因素而导致失衡，就可能导致自由基地蓄积，蓄积的自由基就可以通过氧化应激损伤机体。HO－1抗氧化功能主要是通过其底物的代谢产物胆红素实现的。胆红素的抗氧化性及抗炎作用是近几年才被发现的，其抗氧化能力甚至超过了维生素E和维生素C［3］。作用原理首先是胆红素分子上的白蛋白的不对称性促使胆红素C10上的氢转化为活性氢原子，可与超氧阴离子等自由基结合，使氧自由基等得以清除。另外，胆红素还可清除活性氮和来源于巨噬细胞的次氯酸，减少体内自由基的蓄积。最后，胆红素的抗氧化性和a－维生素E有协同作用。正是通过以上途径发挥其抗氧化能力。如HO－1源性的胆红素可保护培养的内皮细胞、血管平滑肌细胞及心肌细胞免受过氧化氢或过氧化硝基盐引起的细胞凋亡；HO－2源性的胆红素可保护培养的神经细胞，对抗过氧化氢的细胞毒性。在败血症小鼠动物模型实验研究中证实，快速输入胆红素后，可明显降低内毒素对动物模型的损伤，降低模型动物的死亡率。流行病学证实，适当增加体内胆红素的浓度可降低心血管疾病及结肠直肠癌的发病率［4］。

内源性CO主要来源于HO－1降解血红素途径。因CO影响氧的结合与释放，曾被认为是有毒气体。但近来研究发现，CO是继NO之后的另一种重要的气体信使分子，发挥重要的细胞信号转导功能，具有调节血管张力、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制血小板聚集等效应。CO和NO一样，可以通过扩散，以自分泌／旁分泌方式与自身或邻近细胞胞浆内可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）结合，催化产生第二信使环鸟苷酸（cGMP）发挥生理功能。多个研究表明，在HO－1抑制剂阻断内源性HO－1／CO系统后，外源性CO能取得与诱导内源性HO－1同样的抗凋亡、抗炎等效果，提示CO是HO－1／CO系统功能作用的主要介导者。通过抑制上皮细胞、成纤维细胞以及气道平滑肌细胞炎症因子，如 TNFα、IL1－β、IFN－γ的产生，发挥其抗凋亡、抗炎作用。在已知的CO信号通路中，最普遍的是调节sGC的活性，增加cGMP含量，进而抑制血管平滑肌增殖。CO激活的MAPK信号通路是抗炎、抑制细胞凋亡及细胞增殖的重要途径，如p38、JNK1／2、ERK1／2等。不同的细胞类型，其具有不同的信号通路。最近的研究相继发现了CO调节途径的下游效应分子，如70－kD 热休克蛋白（HSP－70）、PPAR－γ、Egr－1、小窝蛋白－1、Toll样受体（TLRs）［5］。另外，CO同样具有抗氧化的作用，作用途径是通过CO抑制NADPH氧化酶，进而下调氧自由基的产生，发挥抗氧化及增殖的作用［6］。

3 HO－1在呼吸系统疾病中的作用 HO－1在肺组织不同细胞中均有表达，如Ⅱ型肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞等，缺氧、高浓度氧、内毒素等均可诱导其表达。作为一种保护性反应，在ARDS、COPD、肺动脉高压、哮喘等疾病时HO－1表达均增加，对于抑制疾病的发展具有重要作用。

3.1 肺动脉高压 动物实验证实，HO－1在肺动脉高压的形成和发展中具有重要的作用。在HO－1转基因小鼠的研究中发现，缺氧诱导的肺动脉高压可被高表达的HO－1完全抑制或明显减轻［7］。相反，在HO－1基因敲除的小鼠中，野百合碱可引起更为严重的肺动脉高压及肺源性心脏病［8］。在HO－1转基因小鼠可明显减轻因缺氧造成的肺部炎症、血管壁增生及肺动脉高压的形成［9］。进一步的研究证实，在严重的肺动脉高压患者中，HO－1表达水平也明显降低［10］。目前的研究提示HO－1的作用机制在于其代谢产物CO。其作用机制：①直接调节MAPK的活性；②激活细胞浆内sGC，产生细胞内cGMP，cGMP可直接或间接通过抑制MAPK而舒张血管，抗炎，抗细胞增殖。

辛伐他汀原本是一种降血脂药物，是HMG－CoA还原酶的抑制剂。近年来动物实验证实辛伐他汀在治疗肺动脉高压方面有一定的作用。细胞学研究证实，应用辛伐他汀处理培养的上皮细胞可明显提高HO－1mRNA表达水平。说明其作用机制可能是通过提高HO－1的表达，达到治疗的作用。阿司匹林，同样可以提高上皮细胞HO－1蛋白表达及活性，增强对抗自由基的能力。临床研究证实，常规辛伐他汀治疗肺动脉高压，可以减轻肺动脉压力及右心室质量，但这种疗效多不超过1年［11］。目前，诱导HO－1表达治疗PAH大多只限于动物实验研究，对于长期HO－1的过渡表达对于机体的损害，相关研究还未见报道。

3.2 阻塞性肺疾病 气道的炎症反应在COPD的形成和发展过程中具有重要的作用。巨噬细胞、中性粒细胞及炎症介质，如蛋白水解酶、活性氧以及细胞因子均参与到这一反应中。目前研究认为蛋白水解酶及抗蛋白酶的失衡，氧化剂及抗氧化剂的失衡是COPD产生的主要机制。在一项烟草提取物对于气道平滑肌细胞作用的研究结果证实，烟草提取物能使平滑肌细胞产生更多的氧自由基，进而通过MAPK途径激活Nrf2，促进HO－1的表达［12］。而HO－1的表达能够抑制气道的炎症反应以及黏液的分泌，进而抑制肺气肿的形成和发展。而此功能均是通过HO－1作用底物的产物CO、胆绿素的抗炎抗氧化作用实现的。越来越多的研究证实，HO－1在抑制COPD的发展中具有重要的作用。研究证实，多种气道细胞，如泡巨噬细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞受到各种刺激后均增加HO－1的表达。刺激肺泡巨噬细胞后，能使其HO－1的表达明显增加，进而使CO产生增加，这也是气道内CO来源的主要途径。体外用香烟烟雾冷凝液处理过的人巨噬细胞，其表达HO－1的能力在最初24h明显增强，而72h后表达能力减弱，推测这一变化是由于烟雾冷凝液影响了Nrf2／Keap1与Bach1相互平衡决定的［13］。高军丽等的研究也证明Bach1和Nrf2可能通过竞争性机制调控 HO－1的表达，影响COPD的发生和发展［14］。应用香烟提取物刺激气道成纤维细胞，HO－1的表达呈剂量依耐性，低浓度提取物（1%～2%）可以刺激气道成纤维细胞表达HO－1明显增加，继而发挥细胞保护的功能。而高浓度提取物（10%）可使气道成纤维细胞HO－1地表达增加更加明显，反而导致氧化应激加剧，致使细胞损伤死亡［15］。另一项研究证实，腺病毒介导的HO－1基因治疗COPD，能明显降低大鼠BALF中 TNF－α、IL－6含量，提高IL－10含量，通过调整炎性因子及趋化因子的分泌，抑制肺气肿的形成和发展［16］。

3.3 支气管哮喘 作为一种过敏性疾病，哮喘的病理特点为炎症细胞和黏液在气道内的聚集，同时又有支气管的收缩。炎症是这一病理过程的中心环节，氧自由基是炎症产生的主要因素。

早在2001年，HO－1在哮喘中的作用已在大鼠的哮喘动物模型中得到证实。研究证实，在吸入HO－1作用底物的产物CO后，哮喘动物模型肺泡灌洗液中嗜酸粒细胞明显减少，致炎因子IL－5也明显减少，而抗炎因子IL－10增加，调节性CD4＋CD25＋比例的提高也抑制了气道免疫反应的强度［17］。在哮喘的临床研究中，呼出CO测定能够判断哮喘发作的严重程度。同正常非吸烟人群比较，哮喘患者，其肺泡巨噬细胞HO－1表达明显增加，呼出CO明显增加。另外，在哮喘患者当中，呼出CO量同峰流速呈相反的关系：呼出CO增加时，其峰流速减少，呼出CO减少时，其峰流速增加。而且，哮喘急性发作时，血液中Hb－CO含量增加，激素控制后其含量减少［18］。而另外研究结果证实，正常人和哮喘患者，呼出CO无明显差异。而且在哮喘患者症状控制前后也无明显差异［19］。

3.4 急性肺损伤 研究表明多种抗氧化酶在ALI／ARDS时表达增高，发挥重要的肺保护作用，HO－1即是其中重要一员。研究表明，HO－1／CO系统有利于细胞防御氧化损伤，减轻脂质过氧化、蛋白质及RNA／DNA氧化等损害。理论上，CO抗炎作用可以用于抑制肺损伤。实验研究证实，用250PPM的CO预处理内毒素制备的急性肺损伤动物模型，血浆中致炎因子 TNF－α，IL－β，IL－6含量减少，动物生存期延长。最近的研究结果证实，HO－1对于急性肺损伤的保护作用是通过下调了Toll样受体4（TLR4），进而抑制了巨噬细胞移动抑制因子（MIF）而起到保护作用的［20］。研究证实，通过气道内滴入腺病毒介导的HO－1，可明显增加抗炎因子IL－10的产生，抑制炎症反应，减轻组织损伤。而HO－1作用产物胆绿素也可抑制内毒素所致的系统性炎症反应，其作用机制是下调致炎因子的产生，同时上调了抑炎因子（如IL－10）的产生。

利用机械辅助通气吸入高浓度的氧气（＞95%）是治疗呼吸衰竭、急性肺损伤常用的方法。但同时会使体内产生大量的氧自由基，加重细胞和器官损伤。增强HO－1蛋白的表达可以有效地抑制中性粒细胞的浸润、死亡，减轻吸入高浓度的氧所致的肺组织损伤，延长模型动物的生存期。吸入高浓度氧对于机体损害机制在于炎症因子产生的增加，而CO可以通过上调p38βMAPK以及其上游的细胞丝裂原活化蛋白激酶（MKK3），抑制炎症因子的产生。在动物试验研究中，吸入CO（250PPM）的机械辅助通气过程中，肺泡盥洗液中TNF－β显著减低，而抗炎因子IL－10明显增加。肺组织提取物中p38βMAPK也明显增加，应用p38βMAPK抑制剂后，IL－10明显减少［21］。以上的研究结果均证实了吸入CO可保护在机械通气导致的肺损伤。另外，HO－1基因启动子GT碱基对重复序列影响着HO－1基因的表达，较长GT碱基对重复序列易于基因的表达，而较短的GT碱基对重复序列则不易于基因的表达。这种表达的增强不但影响着肺动脉高压的发病率，同时也降低了急性肺损伤的发病率［22］。

3.5 特发性肺间质纤维化 特发性肺间质纤维化（IPF）临床较为多见，没有明确的病因及有效的治疗方法。其病理特点是首先侵犯下呼吸道，造成肺泡气体交换发生障碍。目前对于HO－1在IPF中的作用机制仅限于动物研究。博莱霉素造成的肺损伤病理特点同IPF很相似。动物研究证实，HO－1在体内的表达增加可以保护博莱霉素造成动物肺组织纤维化，这种保护作用是通过抑制上皮细胞凋亡，提高IFN－γ来实现的［23］。同样，吸入CO同样可以减弱博莱霉素所致的动物肺纤维化形成［24］。这种保护作用可能是通过抑制成纤维细胞增殖、胶原蛋白沉积来实现的。另外，HO－1作用底物的产物胆红素，同样具有抑制博莱霉素致动物肺纤维化的作用。对于石棉所致的肺纤维化，HO－1也具有保护作用。同正常人相比，矽肺患者血清中HO－1含量是增加的，而且HO－1含量同肺功能呈正相关。而另外的研究却呈相反的结论：IPF肺泡巨噬细胞HO－1表达量较正常减少，且HO－1表达量同肺功能无任何相关性［25］，其机制尚不明确。所以对于 HO－1与IPF的关系尚需进一步的研究证实。

4 研究与展望 大量的细胞学研究及动物实验研究证实，HO－1在呼吸系统疾病中均有保护作用。这种保护作用是通过其作用底物的产物CO、胆红素来实现的。这种作用可以通过提高HO－1的表达或增强其活性来实现。比如利用诱导剂、转基因的途径提高HO－1表达。最近的研究利用干细胞联合HO－1基因治疗肺动脉高压的动物研究已经得到证实［26］。但遗憾的是，目前应用于诱导基因表达的物质以及干细胞治疗其安全性并不可靠，这也限制了在临床的应用。虽然对于CO在呼吸系统的治疗虽然动物实验已经证实，但在临床应用过程中，多大的吸入浓度、吸入的频率、时间以及疗程都是有待于解决的问题。

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