气相色谱-质谱法定性分析麝香保心丸挥发性入血成分的研究

郭黎安，王淑萍，向丽，姜鹏，张卫东，柳润辉(第二军医大学，.训练部;.药学院天然药物化学教研室，上海 200433)

气相色谱-质谱法定性分析麝香保心丸挥发性入血成分的研究

郭黎安a，王淑萍b，向丽b，姜鹏b，张卫东b，柳润辉b(第二军医大学，a.训练部;b.药学院天然药物化学教研室，上海 200433)

目的建立气相色谱-质谱法(GC-MS)定性分析麝香保心丸挥发性入血成分的方法。方法健康雄性SD大鼠给予麝香保心丸混悬液灌服(剂量3.4 g/kg体重)，于口服30 min后肝门静脉取血，蛋白沉淀法处理血浆样品进行GC-MS分析。分析条件:Thermo TR-5 ms色谱柱;Xcalibur色谱工作站;载气为氦气;载气流速为1.0 ml/min;进样口温度为220℃;离子源温度为250℃;梯度升温;进样体积为1 μl;分析时间59 min。结果通过比较麝香保心丸提取液、空白组及给药组，及与在线NIST05数据库比对，共识别和鉴定10个化学成分，其中6个为麝香保心丸中原型成分，其余4个为代谢物。结论本研究建立了一种快速筛选麝香保心丸中挥发性入血成分的方法，可为其深入研究提供基础。

麝香保心丸;血清药物化学;冠心病;气相色谱-质谱联用

麝香保心丸为国家中药保护品种，其经麝香、人参、苏合香、肉桂、蟾酥、牛黄、冰片7种药物配伍组合而成。临床上主要用于冠心病，动脉粥样硬化，心肌缺血及心肌纤维化等的治疗，效果显著。现代药理研究表明，麝香保心丸具有一系列药理活性，其可提高NO的水平［1］、提高内皮型NO合酶基因的表达等作用［2］以及能减轻微小血管的损害，下调MMP-2mRNA和蛋白表达［3］，改善心肌缺血引起的心肌坏死等［4］，尽管对其整体药效机制评价较多，但其主要药理活性成分，即复方主要药效物质尚未得到充分阐明。

由于中药复方为中医药理论指导下的多味药材经配伍组合后的有机整体，先前的生物活性导向下的植化系统分离模式不能完全阐明中药复方的药效物质，因为它忽略了中药复方整体作用机制，而且不能反映中药复方中的化学成分体内动态变化过程。近年来，中药血清药物化学研究已经成为快速筛选中药体内活性成分的一种有效手段。该技术基于“口服中药经胃肠道吸收入血的成分有最大可能成为真正药效成分”的理论，广泛应用于多个中药复方药效成分的筛选［5～7］，成果显著。

麝香保心丸含有的植物二次代谢产物主要分为挥发性成分与非挥发性成分组成。本课题组前期研究已经阐明了其主要非挥发成分［8］，但麝香保心丸中挥发性成分尚未完全探讨。因此，本研究基于中药血清药物化学理论，建立气相色谱-质谱法(GCMS)定性分析中药复方麝香保心丸挥发性入血成分，拟为中药复方的药效物质研究提供技术手段。

1 仪器与试药

1.1 仪器质谱仪:Thermo GC DSQⅡ气相色谱仪;Xcalibur色谱工作站;KS5200H超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司);BP211D型电子天平(德国Sartorius);Anke TGL-16C型离心机;Vortex QL-901型涡旋器。

1.2 试药麝香保心丸制剂由上海和黄药业有限公司提供(批号080105)，麝香酮(批号M0128)、肉桂酸(批号ASB-00003655-025)、肉桂醛(批号YY90307)、龙脑(批号M0297)、异龙脑(批号111512)5种对照品均购自中国药品生物制品检定所，苯甲酸苄脂购自上海鼎瑞化工有限公司。戊巴比妥钠、肝素钠均购自国药集团化学试剂有限公司。正己烷、乙醚、丙酮、氯仿均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 实验动物SPF级雄性SD大鼠，体质量(200 ±20)g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物许可证号SCXK(沪)2003-0003，实验前禁食12 h (自由饮水)。

2 方法与结果

2.1 麝香保心丸分析及灌胃样品制备

2.1.1 麝香保心丸分析样品制备精密称定麝香保心丸样品500 mg，研细，于10 ml容量瓶加入乙醚混悬，超声提取20 min，冷却至室温，乙醚补足损失体积，静置取上清，同法提取两次，滤液合并，12 000 r/min离心10 min。取上清液过0.45 μm微孔滤膜，1 μl进样GC-MS分析。

2.1.2 对照品溶液制备分别精密称取各对照品适量，于10 ml容量瓶中加乙醚至刻度，4℃冰箱中冷藏，备GC-MS分析。

2.1.3 麝香保心丸灌胃样品制备精密称定麝香保心丸样品适量，研细，于锥形瓶中加入0.5%羧甲基纤维素钠制成混悬液(浓度:0.34 g/ml)。20只SD雄性大鼠随机分为溶剂对照组与给药组，每组10只，溶剂对照组大鼠给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌服。给药组大鼠给予麝香保心丸混悬液灌服(剂量:3.4 g/kg)。服药30 min后，所有大鼠腹腔注射1%的戊巴比妥钠溶液(剂量:0.15 ml/kg)麻醉。肝门静脉取血5 ml，置于涂肝素钠的EP管中，4℃，3 000 r/min离心10 min，取上清液，－80℃冰箱冷冻，备用。

2.2 色谱条件Thermo TR-5 ms色谱柱;Xcalibur色谱工作站;载气为氦气;载气流速1.0 ml/min;进样口温度220℃;离子源温度250℃;进样体积1 μl;梯度升温程序见表1;分析时间59 min。

表1 梯度洗脱程序

2.3 质谱条件进样各对照品溶液，优化GC-MS参数，优化的质谱条件:EI源，电子能量70 eV，扫描速度5次/s，发射电流100 μA，扫描周期3 642 amu/ s，离子源温度250℃，扫描质量范围10～650 u。数据分析采用Xcalibur色谱工作站。

2.4 入血成分认定于5 ml EP管中加入血浆样品250 μl，乙醚1 ml，涡旋1 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液，同法萃取两次，合并上清，真空旋转蒸干，残渣加入50 μl乙醚复溶，离心，取上清液1 μl进样GC-MS分析，比较溶剂对照组与给药组质谱图，确定麝香保心丸入血成分。质谱鉴定过程:于40～500 u范围内，分别对空白血浆，给药血浆以及麝香保心丸提取液的GC-MS色谱图以1 μl为间隔单位进行提取，即分别提取40、41、42、498、499及500等离子，对提取离子色谱图进行比较，分析空白血浆和给药血浆离子峰度差异，以此鉴定化合物结构。结果如表2所示。

2.4.1 原型化合物鉴定由于空白血浆与给药血浆的质谱离子流图几乎相同，背景噪音掩盖了目标化合物的响应值。为扣除噪音干扰，本研究采用提取离子的方法对空白血浆与给药血浆图谱进行处理。设定提取离子波动范围±0.5u，原型化合物鉴定方法如上所述，如提取离子m/z 55，空白血浆与给药血浆图谱如图1所示。给药血清图谱中于36.8 min处出现一差异峰，通过与对照品及NIST05数据库比对，该化合物最终被确定为麝香酮。同理，龙脑、异龙脑、苯甲酸苄酯、肉桂醛及肉桂酸经同样方法鉴定。

2.4.2 代谢产物鉴定代谢产物鉴定方法如上所述，当提取离子为m/z 108时，给药后血清和空白血清的提取离子色谱图如图2所示。通过给药血浆与空白血浆对比，于保留时间25.7、26.6及26.9 min处的出现3个差异峰，且在麝香保心丸提取液色谱图中未见，提示其可能为代谢成分。经过NIST05数据库比对，3个化合物被鉴定bicycle［2，2，1］heptan-2-ol，2-allyl-1，7，7-trimethyl，2，6，10－trimethyltetradecane及2-butyl-5-methyl-3-［2-methylprop-2-enyl〛cyclohexanone。

表2 GC-MS鉴定的入血成分和代谢产物

图1 提取离子m/z 55的空白血浆(A)、给药血浆(B)色谱图及差异色谱峰碎片离子图(C)

图2 提取离子m/z 108的空白血浆质谱图

3 讨论

本文基于气相色谱-质谱联用技术，对中药复方麝香保心丸挥发性入血成分进行研究，共确认10个入血成分，包括6个原型成分及4个代谢产物。在已鉴定的这些成分中，很多化合物对心血管疾病有着积极的治疗和预防作用。如肉桂中的肉桂醛能够抑制TNF-α诱导的细胞粘附因子的产生，可以减少血小板聚集和血栓形成，有利于对抗动脉粥样硬化［9，10］。麝香酮抑制血管内皮细胞与中性粒细胞黏附及其表面ICAM-1、VCAM-1和CD44表达，有利于缓解心血管内皮细胞损伤后的炎症反应［11］。只含有龙脑和异龙脑的人工冰片则能使冠状窦血流量回升，减慢心率，降低心肌氧耗量［12］。这些化合物对于心血管积极的治疗作用也从另一方面验证了本研究的可靠性。本研究过程中的方法学优化及结果如下:

3.1 给药剂量确定本研究分别考察了不同给药剂量(0.8、1.7和3.4 g/kg)大鼠血浆中的入血成分，经对比GC-MS图谱主要化合物特征离子(麝香酮m/z 55、肉桂酸m/z 147、龙脑和异龙脑m/z 95)峰度，发现麝香保心丸中主要的挥发性成分在3.4 g/kg剂量下的色谱峰较高，所以给药剂量选择为3.4 g/kg。

3.2 取血时间点的确定本研究分别考察了不同取血时间(15、30、60 min)大鼠血浆中的入血成分，从提取特征离子色谱峰中发现，30 min时间点的血浆样品质谱图中发现麝香酮、肉桂酸、龙脑和异龙脑均有色谱峰出现，给药60 min后取血浆样品质谱图中各目标离子的提取离子色谱峰变小，冰片中龙脑、异龙脑的色谱峰甚至消失。所以选择30 min为最佳时间点。

3.3 样品前处理方法优化本研究分别考察了不同前处理方法对入血成分的影响，经比较，乙醚溶液比正己烷/氯仿(10∶1)混合溶液提取效率要高，正己烷/氯仿(10∶1)混合溶液对麝香酮提取效果较差，所以最终选择乙醚萃取法作为处理血样方法。综上所述，本研究建立了一种快速筛选中药复方麝香保心丸中挥发性入血成分的方法，麝香保心丸药效物质得以最大程度阐释，这些化合物在机体的作用靶点和信息调控机制将是今后深入研究的重点。通过学科间的交叉融合，尤其是生物信息学和生物色谱技术等现代科学技术的的应用有利于揭示中药药效物质对机体的调控机理，展现中药复方多成分、多靶点协同作用的特点，为中药复方现代化研究提供可靠技术手段。

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Identification of volatility components of Shexiang Baoxin pill in rat plasma by GC-MS

GUO Li-ana，WANG Shu-pingb，XIANG Lib，JIANG Pengb，ZHANG Wei-dongb，LIU Run-huib(a.Second Military Medical University，Training Department;b.School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

ObjectiveTo identify the volatile components in rat serum of Shexiang Baoxin Pill(SBP)by gas chromatography couples with mass spectrometry(GC-MS).MethodsSerum samples from control and SBP administration rats were deproteinated by adding methanol prior to gas chromatography.The separation was carried out on a Thermo TR-5 ms column(30 m×0.25 mm I.D.).The inlet temperature was set at 220℃and ion source temperature was 250℃with gradient warming.The carrier gas was N2 with a gas flow rate of 1.0 ml/min，and the injection volume was 1μl.The total analysis time was 59min.The data acquisition were performed on Xcalibur workstation.ResultsTen components including 6 components from SBP and 4 metabolites were observed from a comprehensive analysis of the chromatography of SBP solution.All the observed components were identified by using the online NIST05 library.ConclusionAn integrated method for screening volatile bioactive components in serum after oral administration of SBP was established，which provided helpful information for further mechanism research.

Shexiang Baoxin pill;serum pharmacochemistry;coronary heart diseases;GC-MS

R541.4

A

1006－0111(2012)03－0207－04

10.3969/j.issn.1006－0111.2012.03.013

2012-04-16

［修回日期］2012-05-09

郭黎安(1978-)，女，讲师.E-mail:gla@smmu.edu.cn.

柳润辉.Tel:(021)81871245，E-mail:lyliurh@126.com.