“酒精沼气双发酵耦联工艺”中硫化物对酒精发酵的影响*

刘慧慧，姜立，张成明，张建华，毛忠贵

1(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122)

2(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)

“酒精沼气双发酵耦联工艺”中硫化物对酒精发酵的影响*

刘慧慧1，2，姜立1，2，张成明1，2，张建华1，2，毛忠贵1，2

1(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122)

2(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)

“酒精沼气双发酵耦联工艺”中硫化物会对酒精发酵产生抑制，不利于工艺的稳定运行。与对照相比，pH 4.0，24 mmol/L的硫化物使酒精发酵时间从48 h延长至318 h，酒精产量由90.73 g/L下降至82.28 g/L，酵母数量由3.78×108/mL下降至2.20×108/mL，甘油产量由6.99 g/L上升至11.02 g/L。甘油产量上升是硫化物存在时酒精产量下降的原因之一。硫化物对酒精发酵的抑制性随添加时间的推迟而减弱，这是因为在酒精发酵过程中，硫化物会以H2S的形式随着CO2一起从发酵液逸出。pH 4.0时，硫化物对酒精发酵的临界抑制浓度为1.2 mmol/L。

木薯，燃料酒精，硫酸根，硫化物，临界抑制浓度

木薯是世界上最大的能源作物之一，正逐渐成为我国非粮燃料酒精生产的主要原料。蒸馏废液治理问题已成为木薯燃料酒精进一步发展的“瓶颈”问题，亟需解决。利用传统的“厌氧好氧”生物技术处理蒸馏废液具有投资大、运行费用高，以及处理不彻底等缺点，因此很多学者对酒精蒸馏废液回用工艺进行了研究[1-4］。通常情况下，蒸馏废液的回用比不能超过30%，否则会造成酒精产量的下降[5］。

为了解决蒸馏废液污染问题，根据清洁生产理论并结合本研究室在酒精生产方面积累的经验，提出了木薯燃料酒精的“酒精沼气双发酵耦联”工艺(图1)。在该工艺中，采用高温-中温两级串联厌氧沼气发酵系统来处理蒸馏废液，中温厌氧出水作为下一批次酒精发酵的配料水进行回用，从而解决了蒸馏废液的污染问题，实现了木薯燃料酒精生产的无废(水)制造。在“酒精沼气双发酵耦联”工艺中，摈除了运行成本高的好氧生物处理工艺，降低了污水治理成本;对厌氧出水进行回用还可以节约大量宝贵的水资源，因而具有良好的经济效益和社会效益[6-8］。

在“酒精沼气双发酵耦联”工艺中，中温厌氧出水(pH 7.8～8.2)被用作配料水，配料结束后，料液pH通常在7.0以上，偏离了液化酶作用的最佳pH范围(6.0～6.4)。为了保证良好的液化效果就必须对料液加酸进行调节。厌氧出水强大的缓冲能力(碱度通常在3000～4000 mg/L CaCO3)大大增加了料液pH调节时的硫酸使用量。SO42-在酒精发酵过程中处于“惰性”状态，不会对酵母生长和酒精发酵产生影响。而蒸馏废液中的SO42-会在沼气发酵过程中被还原为硫化物[(方程(1)～(3))］，而硫化物对酒精发酵具有潜在的危害。

图1 木薯“酒精沼气双发酵耦联工艺”流程图

在厌氧出水中(pH 7.8～8.2)，硫化物主要以S2-和HS-的形式存在[9］。但在酒精发酵条件下(pH 4.0～5.0)，硫化物主要以H2S形式存在。当电中性的H2S分子进入细胞内时，会破坏细胞的蛋白质，进而抑制微生物的生长;H2S还可以通过形成硫链来干扰代谢辅酶A和辅酶M，进而影响微生物的生长和代谢。在传统酒精生产中，硫化物不会对酒精发酵产生抑制，因此，未见相关报道。本文的目的在于通过实验确认硫化物对酒精发酵产生抑制的临界浓度，为“酒精沼气双发酵耦联”工艺中配料水(厌氧出水)的水质控制提供数据支撑;同时对硫化物抑制酒精发酵的机理做初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 木薯

河南天冠集团有限公司提供。

1.1.2 菌种

Saccharomyces cerevisiae，安琪酵母股份有限公司生产。

1.1.3 主要试剂和药品

液体耐高温α-淀粉酶(20000 U/mL)、液体糖化酶(130000 U/mL)，无锡杰能科生物工程有限公司产品。其它试剂均为分析纯或优级纯市售商品。

1.1.4 种子培养基(g/L)

葡萄糖 20，酵母膏 8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.06，pH 自然，0.08 MPa灭菌 15 min。

1.2 实验方法

1.2.1 种子培养

接1环生长良好的斜面酵母至200 mL种子培养基中，30℃，200 r/min培养20 h。

3.1.4 猪的室间隔缺损模型 这类模型非常重要，由于这类疾病模型属于自然发生，能够有效模拟人类收缩功能正常的心力衰竭模型[18-19]。

1.2.2 液化

将木薯粉碎，过40目筛，料水比为1∶3(g∶mL)。物料混合均匀后用质量分数为30%的H2SO4溶液调pH至6.0，按10 U/g木薯粉加入耐高温α-淀粉酶，于沸水浴中液化，冷却后用稀碘液作指示剂判断液化终点。

1.2.3 糖化与发酵

将1.2.2中得到的液化液冷却至60℃，用30%H2SO4调节料液pH至实验设定pH，分装于三角瓶，0.08 MPa条件下灭菌15 min;灭菌后冷却至30℃，按130 U/mL培养基添加糖化酶，接入10%(v/v)酵母种子液和0.5 g/L尿素，根据实验设定添加一定量的Na2S溶液，于30℃恒温培养箱中静置发酵。

1.3 分析方法

酒精、甘油、葡萄糖含量利用高效液相色谱检测，检测仪器及色谱条件为:美国Dionex UltiMate 3000 HPLC，示差折光检测器，日本 Shodex RI-101，紫外检测器Dionex UltiMate 3000，分析柱Bio-Rad HPX-87 H离子交换柱，柱温60℃，流动相0.005 mol/L稀H2SO4，流速 0.6 mL/min，进样量 20 μL。

酵母数测定:血球计数板法。

硫化物含量测定:甲基蓝比色法[10］。

2 结果与讨论

2.1 硫化物对酒精发酵临界抑制浓度的确定

在发酵起始pH 4.0条件下，考察了硫化物对酒精发酵的临界抑制浓度。实验中添加的硫化物(Na2S)浓度分别为 0、1.2、2.4、3.6、4.8 和 6.0 mmol/L，实验结果如图2所示。

图2 硫化物对酒精发酵过程中CO2生成量的影响

随着培养中硫化物浓度的增加，酒精发酵时间不断延长(图2)。与对照相比，硫化物浓度为1.2 mmol/L时，发酵时间没有延迟;而当硫化物浓度为6.0 mmol/L时，发酵时间从对照的48 h延长至60 h。从CO2生成曲线上看，为避免硫化物对酒精发酵产生抑制，培养基中硫化物的浓度不能超过1.2 mmol/L。为了探索S2-对酒精发酵抑制的机理，考察了不同起始pH条件下，S2-对酒精发酵中CO2生成、酒精产量、甘油产量以及生物量的影响;此外，还考察了添加时间对S2-抑制性的影响。

2.2 不同初始pH值下硫化物对酒精发酵的影响

根据酵母生长和酒精发酵条件，实验中确定的pH分别为4.0、5.0和6.0，硫化物浓度分别为0、6、12、18和24 mmol/L，每组3个平行，实验结果如图3所示。

在所有pH条件下，S2-均造成了酒精发酵启动的延迟，这种延迟现象随着S2-浓度增大以及培养基pH的下降而更加显著(图3)。例如，当发酵初始pH为4.0，S2-浓度分别为 0、6、12、18、24 mmol/L 时，酒精发酵起始时间分别延迟了0、12、72、174和252 h;当硫化物浓度为12 mmol/L时，随着培养基pH由6.0下降至4.0，酒精发酵起始时间从24 h延长至72 h。在酒精发酵过程中，酵母的对数生长期与CO2生成基本是同步的，这说明，硫化物抑制了酵母的生长。从CO2生成曲线上看，硫化物只是推迟了酒精发酵开始的时间，而对酒精发酵时CO2的生成速率没有明显影响。这意味着，硫化物存在时，酒精发酵时间的延长主要是由于酒精发酵启动被延迟造成的。

图3 不同发酵初始pH时硫化物对酒精发酵过程中CO2生成的影响

H2S是一种二元弱酸，在溶液中分子态形式的比例主要由环境pH所决定，计算公式:

根据计算结果，在硫化物浓度一定时，H2S占总硫化物的比例随着环境pH的下降而增高(表1)，这也是低pH条件下，硫化物抑制性更强的原因。需要指出的是，由于H2S的pKa1较大，即使环境pH为6.0时，H2S占总硫化物的比例也超过91.8%，这也是高pH条件下硫化物依然显示出很强抑制性的原因。

表1 不同pH条件下培养基中硫化物浓度与其对应的H2S浓度

硫化物存在时，不仅会明显延长酒精发酵时间，而且对酒精发酵中的产物具有明显影响，表现为酒精产量和生物量下降以及甘油产量的上升(表2)。以发酵初始pH为5.0为例，当S2-添加量从0 mmol/L增加到24 mmol/L时，酒精产量由90.46 g/L下降至85.06 g/L，下降6.0%;酵母数量由4.57×108/mL下降至1.93×108/mL，下降57.8%;甘油产量由6.93 g/L增加至10.55 g/L，增加52.2%。硫化物可以抑制酵母生长，并减少酒精合成，但是显著促进了甘油的生成。酵母数量的减少主要是因为H2S的存在抑制了其生长，前期研究表明，高浓度硫化物存在时甚至会造成酵母细胞破裂死亡[12］。通常认为，甘油的生产与生物量成正相关关系，但硫化物存在，生物量的下降并未造成甘油的下降，其原因需要进一步分析。

表2 不同初始pH条件下硫化物对酒精发酵的影响

2.2 硫化物的添加时间对酒精发酵的影响

为了进一步确定S2-对酒精发酵的抑制机理，确定抑制酒精发酵的具体阶段，设定在发酵不同时间向培养基中添加一定浓度的S2-。研究接种后0 h、6 h、12 h时加入S2-，每组3个平行。硫化物添加浓度为12 mmol/L(发酵起始pH 4.0及5.0)和24 mmol/L(发酵起始pH 6.0)，发酵过程中CO2产量变化如图4所示。

由图4可知，不同发酵初始pH条件下，S2-对酒精发酵的影响呈现出了相同的规律。接种后加入S2-的时间越早对酒精发酵的抑制作用越强，一旦体系中加入了S2-，培养基CO2生成量即与对照产生差异。以6 h时添加S2-为例，添加硫化物前，CO2生成量变化曲线与对照完全重合;添加S2-后培养基CO2生成量明显较对照减少。接种后12 h添加S2-的发酵实验也表现出相同规律。结果同时表明，硫化物对酒精发酵的抑制性随着添加时间的推迟而减弱。例如，当初始pH为4.0时，硫化物添加时间为0 h时，到接种后80 h才开始酒精发酵，发酵时间长达126 h，而当硫化物添加时间为接种后12 h，CO2生成速度略有减慢，发酵时间缩短至72 h。这种变化规律表明，S2-的加入会严重影响酵母细胞的增殖。发酵初期酵母会大量繁殖满足发酵生产需要，而在发酵进行一段时间后，酵母的生长繁殖相对稳定，添加S2-对发酵的影响大大减小。说明S2-主要的影响体现在对酵母增殖上，而不是发酵性能上。

表3所示为不同发酵初始pH条件下，在发酵不同时间添加相同浓度的S2-对酒精发酵的影响。结果显示，与对照相比，随着添加时间的推后，酒精产量逐渐增大，甘油产量越少。说明培养基中的S2-对酒精发酵的影响主要在发酵的前期，而发酵的前期主要是酵母大量繁殖的过程，由此也可以看出，是由于酵母的生长受到了抑制而导致酒精发酵异常。而且，在发酵开始后加入S2-已经有CO2产生，产生的可以将H2S部分带出，减少发酵培养基中残留的H2S进而减轻了H2S对酒精发酵的抑制作用[13］。

3 结论

同一发酵初始pH值下，随着S2-浓度的增大抑制现象越明显。表现为在初始pH为4.0时，S2-浓度从6 mmol/L增加到24 mmol/L时，发酵延迟时间从20 h延长到260 h左右，发酵结束时酵母数减少量可达50%，酒精产量减少了8.5 g/L。不同发酵初始pH值加入等浓度S2-的发酵实验对比可以得到，pH值越小对发酵的抑制作用越强。同样加入24 mmol/L的S2-，pH值为4.0和6.0时发酵延迟时间分别为260 h左右和110 h左右。而当pH值越低等浓度的S2-转化为H2S的量就越多，说明对酵母发酵有抑制作用的是H2S。

由同一发酵初始pH值在接种后不同时间加入相同浓度S2-的发酵实验结果可以得到，不同时间加入对酒精发酵的抑制作用不同，接种后越早加入硫化物其抑制作用越大。说明H2S主要影响了发酵前期酵母的生长繁殖过程，加入时间越晚，酵母生长发酵过程产生越多的CO2将H2S吹脱带出发酵体系，减少了对酒精发酵的抑制。

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ABSTRACTEthanol fermentation could be inhibited by sulfide，which is harmful to the process of ethanol methane coupled fermentations.Compared to the control，at pH 4.0 and with 24 mmol/L sulfide existed，ethanol fermentation time was prolonged from 48 to 318 h，ethanol concentration was decreased from 90.73 to 82.28 g/L，yeast cell number was declined from 3.78×108to 2.20×108cell/mL，and glycerol concentration was increased from 6.99 to 11.02 g/L.Increased glycerol production could contribute to the decreased ethanol production when sulfide existed.Inhibition of sulfide to ethanol fermentation was weakened as delay of addition，because sulfide could escape from the fermentation broth with CO2as the form of H2S.At pH 4.0，critical inhibition concentration of sulfide to ethanol fermentation was 1.2 mmol/L.cassava，fuel ethanol，sulfate，sulfide，critical inhibition concentration

Key wordscassava，fuel ethanol，sulfate，sulfide，critical inhibition concentration

Effect of Sulfide on Ethanol Fermentation in the"Ethanol Methane Coupled Fermentations"Process

Liu Hui-hui1，2，Jiang Li1，2，Zhang Cheng-ming1，2，Zhang Jian-hua1，2，Mao Zhong-gui1，2
1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
2(School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

硕士研究生(毛忠贵教授为通讯作者)。

*国家863计划项目(2008AA10Z338);江苏省科技支撑计划(SBE201171007)

2012-02-07，改回日期:2012-04-09