阿霉素对sw480细胞端粒酶活性的影响

孟永亮 孙彦 罗小玲

研究发现，蒽醌类药物对许多实体肿瘤显示出良好的疗效[1-3]。但此类药物由于诱发肿瘤耐药的特性及对细胞的毒副作用使其临床上的应用受到限制[4]。其中，阿霉素仍然是研究蒽醌类抗肿瘤药物作用机理及观察蒽醌类药物临床疗效的代表性药物，它可抑制RNA 和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广[5,7-8]，有研究表明，阿霉素作为蒽醌类药物的代表，它可诱导含端粒重复序列的核苷酸形成分子内G4结构，抑制端粒的延伸反应，还可保护端粒重复序列中鸟嘌呤免遭甲基化[5-6]。

1 材料和方法

1.1 材料 大肠癌SW480细胞系购自上海细胞库；盐酸阿霉素（上海佳伦生物科技有限公司，批号922008）；端粒酶活性检测试剂盒（德国Roche公司）；MTT（AMRESCO）；L15培养基（美国Gibco公司）；新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料公司）；二甲基亚砜（美国Sigma公司）；其它常规试剂和仪器（广西医科大学肿瘤学国家重点实验室，山东万杰医学院生物工程省级重点实验室）。

1.2 主要仪器 CO2培养箱（Heal Force）；荧光显微镜（奥林巴斯）；倒置显微镜（奥林巴斯）；PCR扩增仪（bio-rad）全自动酶标仪（美国SHELLAB）。

1.3 细胞培养 饱和湿度条件下的细胞培养箱中常规传代培养sw480细胞，传代比例1:3。

1.4 细胞毒性测定 取对数生长期的sw480细胞制成2×104细胞悬液，取100μl接种于96孔培养皿内,使阿霉素浓度分别达到2.5、5.0、10、20μmol/l,培养24、48、72、96h后，每孔加入MTT液20ul，再培养4h，去上清，加入二甲基亚砜。在酶联免疫检测仪上，测定490nm处的光密度吸收值，计算不同浓度阿霉素对SW480细胞的增殖抑制率。实验重复三次，计算平均值。

根据实验结果，选择经阿霉素作用72小时后细胞生长抑制率在50%以下的最小作用浓度作为随后的作用浓度，防止因阿霉素细胞毒作用过大而干扰观测其对sw480细胞端粒酶活性的影响。

1.5 PCR-TRAT-Elisa端粒酶活性检测试剂盒检测大肠癌sw480细胞端粒酶活性常规方法提取经阿霉素处理不同时间的（24，48，72，96h）的细胞，0.25%胰酶消化细胞，各取2×105个细胞移入EP管。4℃1000rpm离心10min，弃上清，加入裂解液裂解。16000转/min离心，4℃，30分钟，取上清，测定蛋白质浓度，调正为5mg/ml，取待测蛋白50μg(总蛋白)，进行扩增，反应条件如下：

取5μl扩增产物，加入20μl变性试剂，25℃孵育10分钟，再加入225μl杂交缓冲液，振荡混匀后取100μl混合物加入已包被微孔板的孔中，37℃，300pm振荡2小时，弃去杂交液，用清洗缓冲洗三次，加入抗DIG-POD工作液100μl,25℃，30分钟，再用清洗缓冲液洗五次，加入TMB底物溶液100μl,20分钟后再加入100μl终止液终止反应。用酶标仪测定结果A450nm、A630nm的吸光度值（A值）。

阳性结果判断：阳性对照为sw480细胞，阴性标本经65℃、加热30min灭活端粒酶后作为阴性对照。阳性对照吸光度应大于1.5，阴性对照吸光度应小于0.25，待测标本⊿A＝标本吸光度A值－阴性对照吸光度A值，若标本A＞0.2，即为端粒酶阳性。

2 结果

2.1 阿霉素抑制sw480细胞增殖的量效及时效关系

MTT结果显示，阿霉素抑制SW480细胞增殖具有浓度和时间依赖性，即药物作用浓度越大，作用时间越长，其对细胞的抑制作用最明显，阿霉素作用72h后，2.5μmol/L和5.0μmol/L阿霉素的生长抑制率在50%以下，而10μmol/L、20μmol/L的阿霉素生长抑制率在50%～100%之间（图1），依据此MTT结果，本研究选择5μmol/L作为随后实验的作用浓度，作用时间72h。

图1 MTT检测细胞增殖结果

2.2 各组细胞的端粒酶活性情况

随处理时间延长，实验组细胞端粒酶活性逐渐降低，72h后达到最低（P＞0.05）；见表1，图2。

表1 加药不同时间点各组端粒酶活性比较（±s,n=3）

表1 加药不同时间点各组端粒酶活性比较（±s,n=3）

注：a与其他组比较

A值空白对照组 2.11±0.147加药24h组 1.96±0.126加药48h组 1.83±0.108加药72h组 1.65±0.137a加药96h组 1.62±0.145a组别

图2 加药不同时间点各组端粒酶活性比较

3 讨论

阿霉素的细胞吸收和细胞毒性实验已在一系列人肿瘤细胞和正常细胞系内进行[5-6,9]，为避免严重细胞毒作用对细胞端粒酶活性检测的干扰，便于观察其生物学性状变化，本研究首先进行了阿霉素细胞毒性实验，依据实验结果，确定了5μmol/L阿霉素作为本研究的实验作用浓度。在TRAP检测中，上述作用浓度的阿霉素对sw480细胞端粒酶介导的端粒延伸反应有明显抑制作用。说明5μmol/L是较合适的实验作用浓度，不会产生过大的细胞毒作用，在抑制细胞增殖的同时，可以对其端粒酶活性产生抑制作用。

本部分实验旨在针对人大肠癌sw480细胞株单独给予阿霉素，检测在阿霉素单独作用下细胞的增殖情况，检测sw480细胞内靶基因hTERT和端粒酶表达的变化，为以后研究综合研究阿霉素在促进G-四链体形成，稳定端粒，抑制肿瘤细胞增殖方面存在的潜力奠定研究基础。

[1]Sui G，Soohoo C,Affar,et al.A DNA vector-based RNAi technology to suPPress gene expression in mammalian cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(8):5515-5520.

[2]Huang, S.T.,Wang cr,Yang Rc,et al., Wogonin, an active compound in Scutellaria baicalensis, induces apoptosis and reduces telomerase activity in the HL-60 leukemia cells[J]. Phytomedicine, 2010. 17(1): 47-54.

[3]Wei, X,Zhang Z,He M, et al. Effects of differentially expressed proteins in hepatocellular carcinoma cell treated by different telomerase inhibitors[J]. Wei Sheng Yan Jiu, 2010, 39(2): 242-245.

[4]Yamada, O., et al.Ozakik,Furukawa T,Activation of STAT5 confers imatinib resistance on leukemic cells through the transcription of TERT and MDR1[J]. Cell Signal, 2011,23(7):1119-1127.

[5]Yang, Y., Q.Y. Du, and S.Q. Wang.Synergism of an antisense oligodeoxynucleotides targeted to hTERT in combination with chemotherapeutic drugs on inhibiting the proliferation of HepG2 cells[J]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi, 2003, 11(12): 719-721.

[6]Yang, Y. Lv QJ, Du QY, et al., Combined effects of Cantide and chemotherapeutic drugs on inhibition of tumor cells' growth in vitro and in vivo[J]. World J Gastroenterol, 2005,11(16): 2491-2496.

[7]Hillier, C.,Pe the Me, love MP, et al., Effect of adrenomedullin on the production of endothelin-1 and on its vasoconstrictor action in resistance arteries: evidence for a receptor-specific functional interaction in patients with heart failure[J]. Clin Sci (Lond), 2001,101(1): 45-51.

[8]王孝养，张珍祥.顺铂和依托泊苷下调非癌细胞端粒酶量及端粒酶逆转录酶的表达[J].中国药理学与毒理学杂志，2002，16（1）：41-46.

[9]Han H,Hurley LH.G-quadruplex DNA:a potential Target for Anti-Cancer Drug Design.Trends Pharm Sci,2000,21(4):136-142.