响应面分析法优化罗汉果黄酮提取工艺条件的研究

崔 彬，冯静弦，胡 琪，饶力群

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

黄酮类化合物是植物代谢过程中产生的一类重要天然有机化合物，广泛存在于自然界的植物中，属植物次生代谢产物，近年来一直是国内外研究开发的热点[1]。黄酮类化合物是以黄酮（2-苯基色原酮）为母核的一类衍生物[2]。它在植物界分布很广，在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在，也有的以游离形式存在。黄酮类化合物具有抗抑郁，抗氧化与消除自由基活性的作用，近年来被广泛应用于医药领域[3]。

目前我国对罗汉果的广泛使用主要在于提取甜苷，但其中黄酮类化合物含量也很高[4]。陈全斌等[5]利用反相高效液相色谱法，证实了罗汉果中含有黄酮苷元山奈酚，并首次发现含有黄酮苷元槲皮素，测得罗汉果鲜果中总黄酮含量5～10 mg/个，甜苷中总黄酮含量为1.42%。所以开发利用罗汉果黄酮有实际意义。

响应面分析法（Response Surface Methodology，RSM）是一种优化工艺的有效方法，是利用合理的试验设计采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过回归方程寻求最优工艺参数的一种实验设计方法和数据统计方法[6-7]。近年来，响应面分析法已越来越多地应用于工业生产中。本文以罗汉果黄酮的得率为响应值，在单因素试验的基础上，利用响应面法对罗汉果黄酮的提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺，以提高罗汉果黄酮的提取效率，得到高纯度的黄酮产品。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原 料 罗汉果果实购于长沙市高桥批发市场，剥壳，粉碎，备用。

1.1.2 试 剂 无水乙醇、超纯水、氢氧化钠（AR），天津市大茂化学试剂厂；亚硝酸钠（AR），湖南汇虹试剂厂；硝酸铝（AR），天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器与设备 RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；电热恒温风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；回流提取仪和ALZ04电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；FW177中草药粉碎机，天津泰斯特；紫外-可见分光光度检测器，Agilent1100。

1.2 试验方法

1.2.1 罗汉果黄酮的提取 精确称取5 g罗汉果粉末于圆底烧瓶中，加入一定量一定浓度的乙醇，在一定温度下浸提一定时间，提取液抽滤，浓缩回收乙醇，得粗提液。

1.2.2 标准曲线的测定 精密吸取标准芦丁溶液1、2、3、4、5 mL，分别置于 10 mL 刻度试管中，精密加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min，加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min，再加入4%氢氧化钠溶液4 mL，最后用30%乙醇定容至10 mL，摇匀后放置15 min，置于比色皿中，在500 nm处测定吸光度，标准曲线的回归方程为：y=1.284 x+0.143（R2=0.994 7）

1.2.3 测定方法 精密吸取提取液1 mL置于10 mL刻度试管中，按照1.2.2中的方法测定吸光度。用以下公式计算得率：e=Y×n×V/W×100%，其中Y为黄酮类物质质量浓度（mg/mL），V为原提取液体积（mL），W为罗汉果样品质量（mg），n为稀释倍数。

1.2.4 响应面法优化提取条件 在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken方法，选取主要影响因素为自变量，得率（%）为响应值。通过响应曲面进行罗汉果黄酮提取工艺的优化。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

按1.2.1方法，选择乙醇浓度，提取时间，料液比，提取温度为单因素，考察不同条件对提取效果的影响。结果如图1～4。

图1 乙醇浓度对得率的影响

图2 提取时间对得率的影响

2.2 响应面法优化罗汉果黄酮的提取工艺

根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验结果基础上，选取乙醇体积分数，提取温度，提取时间3个因素的合适水平，对提取工艺进行三因素三水平响应面分析试验，因素水平设置见表1。

图3 料液比对得率的影响

图4 提取温度对得率的影响

表1 响应面中心组合试验因素与水平

对罗汉果黄酮提取工艺进行响应面分析，具体试验方案及结果见表2。

表2 响应面分析方案及试验结果

2.2.1 方差分析和二次回归方程拟合 利用Design Expert软件对试验结果进行二次多元回归拟合，得到以罗汉果黄酮得率为响应值，与编码自变量 X1，X2，X3的二次多项回归方程：

模型的可靠性可从方差分析及相关系数来考察（表3）。结果表明，模型拟合度高，p<0.05，回归模型的决定系数为0.956 5。失拟的Pr＞F值为0.056 2，是不显著的，说明数据拟合效果较好，能够很好地描述试验结果。因此，可以用此模型对罗汉果黄酮得率进行分析和预测。由表3中的F值检验可以得到因子贡献率为X1>X2>X3，即乙醇浓度>提取温度>提取时间。

表3 响应面分析方案与试验结果

2.2.2 交互作用分析 各因素X1、X2、X3对响应值得率所构成的三位空间的曲面图，可反映各因素对其响应值的影响。响应面图可较为直观地看出各因素对得率的影响，曲线越陡峭，表明该因素对得率的影响越大，由等高线图可以看出存在极值的条件应该在圆心处。图5～7表明，在所选的各因素水平范围内，对罗汉果黄酮得率的影响以乙醇浓度（X1）最大，提取温度次之（X2），提取时间（X3）的影响最小。这也符合表3的方差分析结果。

图5 乙醇浓度和提取温度对罗汉果黄酮得率的响应面图和等高线图

图6 乙醇浓度和提取时间对罗汉果黄酮得率的响应面图和等高线图

图7 提取温度和提取时间对罗汉果黄酮得率的响应面图和等高线图

2.2.3 验证试验 在软件给出的处理方案中，本试验选择的最佳工艺条件为乙醇浓度76.59%，提取温度84.29℃，提取时间0.76 h时，预测得率最优值为1.573%。根据选择的最佳工艺，调整罗汉果黄酮提取的工艺条件为乙醇浓度77%、提取温度85℃、提取时间48 min，进行验证试验，3次平行试验得到罗汉果黄酮提取液实际得率为1.538%。

3 结论

响应面分析方法是研究集中因素间交互作用的回归分析方法，用该方法研究罗汉果黄酮提取工艺参数，求得的回归方程精度高，可以准确找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。该方法通过响应面图直观分析了各因素对罗汉果黄酮得率的影响，以及各因素之间对提取过程的交互影响。

通过Design-Expert7.0软件采用Box-Behnken实验设计对罗汉果黄酮提取工艺参数进行优化，得到了最佳提取工艺，结合生产实际，可调整罗汉果黄酮提取的最佳工艺条件为乙醇浓度77%、提取温度85℃、提取时间48 min，验证试验的实际得率为1.538%，与理论值接近，说明响应值的试验值与回归方程预测值吻合良好，优化结果可信，具有实用价值。

[1]张鞍灵，高锦明，王姝清.黄酮类化合物的分布及开发利用[J].西北林学院学报，2000，15（1）：69-74.

[2]孙丽霞，成 蓓，王冬梅.果实类中药材植物种植技术[M].北京：中国林业出版社，2001.113-124.

[3]王雪芬，陈再智，等.罗汉果的药理及其应用研究[J].中药材，2003，26（10）：771-772.

[4]斯建勇，陈迪华，常 琪，等.鲜罗汉果中黄酮苷的分离及结构测定[J].药学学报，1994，29（2）：114-120.

[5]陈全斌，杨瑞云，义祥辉，等.RP-HPLC法测定罗汉果鲜果及甜苷中总黄酮含量[J].食品科学，2003，24（5）：133-135.

[6]张润楚，郑海涛，兰 燕.试验设计与分析及参数优化[M].北京：中国统计出版社，2003.

[7]HILL W J,HUNTER W G.A review of response surface methodology：a literature review[J].Technometrics,1966,8:571-590.