复合酶解米渣制备蛋白肽的理化与功能性质研究

黄声芳，杜研学，熊 华，窦晓凤，蒋 岩，王深旗

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047）

复合酶解米渣制备蛋白肽的理化与功能性质研究

黄声芳，杜研学，熊 华*，窦晓凤，蒋 岩，王深旗

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047）

以米渣为原料，采用复合酶解法制备高水溶性米渣蛋白肽，并对其理化与功能性质进行了分析。结果表明：米渣蛋白肽中总肽含量为88.93%，短肽含量为13.05%，总糖含量为3.14%；氨基酸组成合理，能很好地满足体内营养需要；水中溶解度在pH9.0时最大，为99.15%；乳化性及乳化稳定性均呈现较好变化趋势，乳化性在pH9.0时最大，乳化稳定性在pH11.0时最大。

米渣蛋白肽，复合酶解，溶解性，乳化性，乳化稳定性

米渣是大米深加工生产味精、糖浆的副产物[1]，在我国南方产量很大。据初步估算，目前仅江西每年就有3～5万t米渣产出。米渣中蛋白质含量约为65%，含人体必需的八种氨基酸，且氨基酸组成合理[2]，属优质植物蛋白。米渣由于水溶性极差，不易被机体吸收，难以应用至食品加工中，目前大多作为动物饲料，生物利用率及经济价值均较低[3]。从米渣中提取大米蛋白的方法主要有碱溶酸沉法、碱酶两步法及酶解法等。碱溶酸沉法、碱酶两步法均因采用了较高浓度的碱液而使赖氨酸、丝氨酸等氨基酸遭到不同程度的破坏，且形成味苦、对身体有害的物质[4]。酶解法反应温和、反应条件易控制，同时可将分子量较大的米渣蛋白降解为分子量较小的肽链，可用于开发具有新型生理功能的大米小分子肽[5]。实验证明，相对分子质量小，尤其是小于1ku的寡肽极易被人体小肠吸收利用，并迅速参与机体内氨基酸分子和蛋白质的合成[6]。某些寡肽还具有降血压、抗氧化等独特生理功能[7-9]，可作为食品原辅料用于保健品、饮料、婴幼儿奶粉、速溶食品等产品中，同时可用作制备肉味香料的前体物质[10]，具有极大的开发利用和经济价值。目前已有关于酶解法制备米渣蛋白肽的报道，但多采用单一酶解法，制得的米渣肽粉末流动性差、分子量大，且溶解性、乳化能力等功能性质较差[3]。本实验以米渣为原料，采用先预处理再复合酶解的方法制备米渣肽，产品为流动性良好的均匀粉体，易溶于水，溶液澄清透明，低苦涩味，同时有效地提高了米渣肽的蛋白含量，短肽含量高。本文主要研究了复合酶解方法所制备米渣肽的理化指标、营养及功能性质，以期为米渣肽的开发与利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干米渣 江西恒天实业有限公司，成分见表1；纤维素酶（15000U/g）、α-淀粉酶（3000U/g）、胰蛋白酶（4000U/g）、复合蛋白酶（3000U/g） 无锡市酶制剂厂；大豆油 益海嘉里食品营销有限公司；十二烷基硫酸钠（SDS） 美国Sigma公司，分析纯；硫酸钾、硫酸铜、氢氧化钠、3，5-二硝基水杨酸等其他试剂 均为分析纯。

KDY-9820凯氏定氮仪 厦门精艺兴业科技有限公司；飞鸽牌LXJ-ⅡB离心机 江西鼎技科学仪器有限公司；HHS电热恒温水浴锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；FSH-Ⅱ高速电动匀浆机 江苏金坛市环宇科学仪器厂；QZP-8移动式高速离心喷雾干燥机 无锡市林洲干燥机厂；755B紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；电子天平 Mettler toledo仪器公司；FTIR Nicolet 5700傅立叶红外光谱仪 美国尼高力公司；S-433D氨基酸分析仪 上海时弈生物工程有限公司；U-1800紫外可见扫描仪 西安森冉生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 米渣酶解工艺流程 米渣→加水→纤维素酶水解→α-淀粉酶水解→离心→水洗（两次）→离心，去上清液→加水→调节温度、pH→加酶复合酶解→升温灭酶→离心→上清液→喷雾干燥

称取100g米渣，加入600mL去离子水，调节温度50℃及pH5.0，加入0.2%（酶与米渣比值，下同）纤维素酶反应1.5h，升温至90℃，调节pH6.0，加入0.8%α-淀粉酶反应1.5h，离心，倾去上清液，加水搅拌，离心，倾去上清液，重复水洗一次，得到米渣浓缩蛋白，加800mL去离子水，调节温度50℃及pH8.2，同时加入0.5%胰蛋白酶和0.2%复合蛋白酶，反应2.5h，升温灭酶，离心，得到澄清透明的酶解液，喷雾干燥，得到乳白色米渣肽粉。

1.2.2 米渣肽理化性质测定 水分的测定（105℃恒重法GB5497-85）；灰分的测定（550℃灼烧法GB5512-85）；脂肪含量的测定（索氏提取法GB5511-85）；蛋白质及肽含量的测定（半微量凯氏定氮法GB/T5009.5-2003）；总糖含量的测定（3，5-二硝基水杨酸法）[11]；氨态氮（甲醛滴定法GB/T5009.39-2003）；样品酶解过程中蛋白质提取率（RE）及水解度（DH）的测定[1]如式（1）和式（2）。

1.2.3 相对分子质量分布及短肽含量测定 米渣肽相对分子质量分布参照文献[12]的凝胶液相色谱法；文献[13]中将相对分子质量MW＜1ku的肽定义为短肽，其含量的测定采用三氯乙酸沉淀法（TCA）[14]。具体操作为：称取一定量的米渣肽样品于烧杯中，加入25mL 15%的TCA溶液，搅拌均匀后以10000r/min离心5min，取上清液，过滤，取定量滤液至消化管中，用半微量凯氏定氮法测定短肽含量。

1.2.4 氨基酸组分分析 采用S-433D氨基酸分析仪[15]。称取5mg米渣肽样品，加入5.8mol/L HCl，110℃下真空消化24h，冷却，定容，稀释。过0.45μm滤膜，待上机。用异硫氰酸苯酯进行柱前衍生，分析条件：色谱柱：4.6×60mm，Na型阳离子交换树脂；流动相：柠檬酸三钠缓冲液；四元梯度洗脱：pH3.2～4.9；检测波长：510nm；流速：0.4mL/min；柱温：50℃。

1.2.5 水中溶解度测定 测定方法参照文献[16]并作调整，考察米渣肽样品在不同pH条件下溶解度的变化。操作步骤如下：精密称取0.2000g米渣肽样品，加入20mL去离子水，配制成样品浓度为1%的蛋白液，调节pH2.0～13.0，50℃磁力搅拌30min，样品充分溶解；转入离心管，4800r/min转速离心10min，过滤，取上清液，以Folin-酚法测定蛋白质含量，得到样品在各pH的可溶性蛋白含量。每组实验做三组平行对照。

式中：粗蛋白含量由半微量凯氏定氮法测定。

1.2.6 乳化能力的测定 乳化能力包括乳化性（EAI）和乳化稳定性（ESI）。乳化性指蛋白质和油水结合形成乳状液的能力，而乳化稳定性体现了乳状液保持稳定的能力[17]。采用浊度法测定[18]，具体测定步骤如下：称取0.10g样品，溶解于去离子水中，配成浓度为1mg/mL的溶液，取其中8mL与2mL大豆油混合于50mL离心管中。在高速电动匀浆机下乳化1min（13500r/min）。在离底部0.5cm处，立即取样50μL与5mL 0.1%的SDS溶液充分混合，在500nm波长处测定吸光值（A0），同时以5mL 0.1%的SDS溶液做空白对照。每组实验做三组平行对照。

式中：A0-500nm处测得吸光值；N-稀释倍数；C-蛋白质水溶液中蛋白质浓度（g/mL）；Φ-乳化液中油的体积分数（L/L）。

静置10min后再次取样，按同样步骤测定吸光值（A10），得到乳化稳定性：

式中：△t=10min；△A=A0-A10。

每组实验做三组平行对照。

2 结果与讨论

2.1 米渣及米渣肽的理化成分含量比较

表1 米渣及米渣肽各理化成分含量（%）Table 1 Physical and chemical compositions of the rice residue and rice residue peptide（%）

表2 米渣肽相对分子质量分布Table 2 Molecular weight distribution of the rice residue peptide

由表1可知，原料米渣中总糖含量为18.30%，米渣肽的总糖含量仅为3.14%，表明在肽制备过程中，纤维素酶和α-淀粉酶降解了米渣中大部分纤维素和淀粉，转化为可溶性糖被除去，预处理对米渣肽的制备起到了重要作用。米渣肽中水分、脂肪和总糖含量均低于原料米渣，灰分略有升高，是由于在酶反应过程中pH调节时加入了少量NaOH。米渣肽主要成分为蛋白及少量糖分，是有益于机体的易吸收成分；水分和脂肪总含量为3.21%，非常有利于产品的长期保存。

2.2 米渣肽提取率（RE）及水解度（DH）

经测定，制备米渣肽的RE值为37.52%，DH值为22.39%。文献[19]中用胰蛋白酶酶解米渣，当底物浓度为8%，酶与底物比值为5%，水解5h后，得到胰蛋白酶对米渣的RE值为77.24%，DH值为21.80%，其他条件不变，水解时间变为6h，RE值为83.02%，DH值为25.03%。而本研究的米渣肽制取过程，底物浓度为12.5%，酶与底物比值仅为0.7%，酶解时间为2.5h，过程大大减少了酶用量、酶解和水洗过程的水用量及加热时间，更接近实际生产，节约了成本。

2.3 米渣肽的相对分子质量分布及短肽含量的测定

由TCA法测得米渣肽中短肽占总蛋白质含量的13.05%。由表2可知，米渣肽相对分子质量<10ku占98.33%，相对分子质量为1ku

表3 米渣及米渣肽的氨基酸比较Table 3 Amino acids comparison of the rice residue and rice residue peptide

2.4 米渣肽氨基酸组成

由表3可知，米渣和米渣肽的氨基酸含量均能完全满足FAO/WHO推荐的成人需要量，氨基酸组成合理、平衡。米渣中谷氨酸含量（21.31g/100g）最高，天门冬氨酸和亮氨酸为其次，半胱氨酸的含量最低。米渣经酶解后，米渣肽中部分必需氨基酸的量有所下降，如缬氨酸、蛋氨酸和亮氨酸分别降低了0.51、0.55、0.72g/100g蛋白，而苏氨酸和赖氨酸分别提高了0.60、0.55g/100g蛋白，但总体组成变化小。比较酶解前后非必需氨基酸的变化，脯氨酸、精氨酸和天门冬氨酸含量得到明显提高。现代营养学研究表明：精氨酸为条件性必需氨基酸，是婴幼儿成长阶段的一种必需氨基酸，精氨酸供给不足，可能导致微血管内皮功能的损伤，并影响其生长性能[20]；天门冬氨酸是肠道重要的能量来源，是小肠粘膜生长和完整性、粘膜对抗外界毒性物质和过氧化损伤的防护作用所必需的[21]。

2.5水溶性测定

图1 pH变化对米渣肽水溶性的影响Fig.1 Effect of pH on the water-solubility of the rice residue peptide

由图1可知，pH在2.0～5.0范围，米渣肽溶解度随pH增大而降低，在pH5.0（等电点附近）时最低，为79.08%，后随pH增大而增大，在pH9.0时达到最大值，此时溶解度为99.15%。pH继续增大，可以观察到少部分肽沉淀，溶解度稍有降低；当pH达到13.0时，溶解度降低到91.00%，但降低幅度并不明显，表明强碱环境对米渣肽溶解性影响不大。相对而言，过酸的环境则更不利于米渣肽的溶解。可能是由于米渣肽中同时存在酸溶性和碱溶性肽[22]，且碱溶性肽比例小于酸溶性肽，导致溶液偏酸性时碱溶性肽处于沉淀状态，整体溶解度偏低，而pH>9.0的强碱性溶液导致酸溶性肽沉淀下来，在pH9.0附近因其弱碱环境，酸溶性肽沉淀率还很低，碱溶性肽却得到很好地溶解，因此溶解度达到最大。也可能是由于过酸或过碱环境不同程度地导致蛋白肽少部分变性。总体而言，溶液酸碱环境对米渣肽溶解性影响较小，溶解性范围为79.08%～99.15%。

米渣蛋白酶解过程有效提高了蛋白质的溶解性，改善了米渣肽溶解特性，将有利于拓宽其在食品中的应用范围[23]。

2.6 米渣肽乳化性及稳定性

图2 pH变化对米渣肽乳化性的影响Fig.2 Effect of the pH on the emulsifying ability of the rice residue peptide

图3 pH变化对米渣肽乳化稳定性的影响Fig.3 Effect of the pH on the emulsifying stability of the rice residue peptide

由图2可知，在pH3.0～7.0范围内，米渣肽乳化性增幅较小，pH7.0后，乳化性迅速增强，在pH9.0达到最大值，之后随pH上升而下降，可发现米渣肽乳化性随pH变化趋势与溶解性表现出较强相关性，可能是由于溶解性的增大使大量分子进入水相中，从而吸附更多的油脂分子，从而增大了其乳化性，在pH>9.0时，溶解性下降，其乳化性也随之降低。

由图3可知，乳化稳定性在pH3.0～9.0范围内保持基本稳定，之后迅速上升，在pH11.0时达到最大，最后下降。乳化稳定性随pH的变化趋势可能是由于乳化体系形成过程中不同pH环境使肽粉的载量及油水界面张力不同，继而影响了其乳化稳定性，pH9.0～11.0范围内的乳化稳定性呈大幅上升趋势，表明适宜碱性环境有利于降低油滴的油/水界面张力，而弱碱及强碱环境均会提高油滴的油/水界面张力，不利于乳化液的稳定[24]。

3 结论

米渣采用复合酶解，经喷雾干燥后得到的米渣肽为流动性良好的均匀粉体，灰分及脂肪含量低，其氨基酸组成合理，短肽含量高，水溶解后溶解度高，乳化性及乳化稳定性均随pH变化呈现较规律性变化，具有很大的开发和利用价值。

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Physicochemical and functional properties of the peptide prepared by compound enzymatic hydrolysis of rice residue

HUANG Sheng-fang，DU Yan-xue，XIONG Hua*，DOU Xiao-feng，JIANG Yan，WANG Shen-qi
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

The rice residue was hydrolyzed by using compound enzymatic hydrolysis for the production of peptides with high water solubility.The physicochemical and functional properties of the prepared peptides were characterized.The results showed that the peptide proportion of the sample prepared was up to 88.93%with 13.05%short peptides.The peptide showed a balanced amino acid profile，which could well meet the nutritional requirement in vivo.The maximum solubility of the prepared peptide was observed at pH9.0，which reached 99.15%.The emulsifying property of the rice residue peptide showed a regular change in a wide pH range and the maximum emulsifying ability of rice residue peptide was observed at pH9.0.The maximum emulsifying stability was observed at pH11.0.

rice residue peptide；compound enzymatic hydrolysis；solubility；emulsifying property；emulsifying stability

TS201.2+1

A

1002-0306（2012）07-0075-05

2011－06－20 * 通讯联系人

黄声芳（1987-），女，硕士研究生，研究方向：食物（含生物质）资源开发与利用。

南昌大学食品科学与技术国家重点实验室目标导向项目（SKLF-MB-201005）；国家发改委专项（发改投资[2009]2825号）；江西省高新技术产业化重大项目（赣财教[2008]212号）。